Summary
تقدم هذه الورقة وصفاً مفصلاً لكيفية بناء نموذج حيواني للمرحلة الـ"هيبد" (نقص التروية في الكبد) في الفئران لتسهيل البحوث الأساسية في إصابة الإقفار في الدم بعد زرع الكبد.
Abstract
زرع الكبد التقويمي (OLT) في الفئران هو نموذج حيواني مجربة ومثبتة يستخدم في الدراسات قبل الجراحة، وفيما بين العمليات، و ما بعد العملية الجراحية، بما في ذلك إصابة الإقفاريات-إعادة الحقن (IRI) للأعضاء خارج الجسم. يتطلب هذا النموذج العديد من التجارب والأجهزة. ترتبط مدة المرحلة الوهنية ارتباطًا وثيقًا بالوقت الذي يتم تطويره بعد الزرع. في هذه التجربة، استخدمنا التغيرات الديناميكية الدموية للحث على تلف الأعضاء خارج الكبد في الفئران وحددنا أقصى وقت للتسامح. الوقت حتى أشد إصابة الجهاز تختلف لمختلف الأجهزة. يمكن بسهولة تكرار هذه الطريقة ويمكن استخدامها أيضا لدراسة IRI من الأعضاء خارج الكبد بعد زرع الكبد.
Introduction
إصابة الإقفاري بالوريد (IRI) هي من المضاعفات الشائعة بعد زراعة الكبد. IRI الكبد هي عملية مرضية تنطوي على تلف الخلايا بوساطة الإقفاريات وتدهور غير طبيعي في تكاثر الكبد. يمكن تقسيم IRI الكبدية والاستجابة المناعية الفطرية المحلية إلى IRI الساخنة والباردة، وفقا للاختلافات في البيئة السريرية1. يتم حث IRI الساخنة من قبل إصابة الخلايا الجذعية، وعادة نتيجة لزرع الكبد، صدمة، والصدماتالنفسية 2. IRI الباردة هو من مضاعفات زرع الكبد الناجمة عن الخلايا البطانية والدورة الدموية الطرفية3. وقد أظهرت التقارير السريرية أن يرتبط IRI الكبدي مع 10٪ من فشل الجهاز المبكر، ويمكن أن تزيد من حدوث الرفض الحاد والمزمن4,5. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي IRI الكبدي أيضًا إلى متلازمات خلل وظيفي متعددة في الأعضاء أو متلازمة الاستجابة الالتهابية النظامية ، مع ارتفاع معدل الوفيات6. المرضى الذين يعانون من مشاركة الجهاز خارج الكبد تميل إلى البقاء لفترة أطول في المستشفى، تنفق المزيد من المال، ويكون أسوأ التكهن7. ويرتبط تطور المضاعفات ارتباطا وثيقا بطول المرحلة الالكبدة من زرع الكبد8.
تم الإبلاغ عن زراعة الكبد التقويمي (OLT) في الفئران لأول مرة من قبل البروفيسور الأمريكي لي في عام 1973. تحاكي العملية التجريبية خطوات زراعة الكبد السريرية وosistomosis الأوعية الدموية والقناة الصفراوية المشتركة (CBD) باستخدام طريقة الغرز. الإجراء صعب وتستغرق وقتا طويلا مع معدل نجاح منخفض9. في عام 1979، أدلى كامادا وآخرون تحسنا كبيرا OLT في الفئران باستخدام خلاق 'طريقة اثنين الكفة' لالتموخ من الوريد المدخل للسيطرة على المرحلة anhepatic في غضون 26 دقيقة10. في العام نفسه، اقترح زيمرمان "طريقة الدعامة الصفراوية الفردية". على أساس عمل لي، استخدم زيمرمان أنابيب البولي إيثيلين إلى أنستيوميوس مباشرة اتفاقية التنوع البيولوجي للمتبرع والمتلقي، وتبسيط إعادة بناء اتفاقية التنوع البيولوجي، والحفاظ على وظيفة العضلة العاصرة، وأصبحت هذه الطريقة المعيار لإعادة بناء الصفراوية من نماذج OLT11. في عام 1980، اقترح مياتا وآخرون "طريقة الكفة الثلاثية" حيث تم استئصال الوريد البوّلي (PV) و vena cava (SVC) وداخلي الكبدي (IVC) بواسطة طريقة الكفة. ومع ذلك ، هناك خطر تشويه القنية مع هذه الطريقة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى عرقلة السفلية فينا كافا الجزر12. في عام 1983، تم اقتراح "طريقة الكفتين" باستخدام طريقة الكفة لتمتُس الفلطائن من الفلطائية الضوئية و IVC، ولكن اعتماد طريقة خياطة SVC13. وقد اعتمد العلماء هذه الطريقة على الصعيد العالمي لإنشاء نماذج OLT. ومنذ ذلك الحين، تم تحسين الخطوات تانوميسيس الكفة لتقصير المرحلة anhepatic وتحسين معدل البقاء على قيد الحياة من الفئران14. وبالمثل، يتم استخدام أساليب محسنة في الممارسة السريرية لتقصير المرحلة anhepatic15. ومع ذلك، أظهرت الأبحاث الأساسية في IRI بعد زرع الكبد أن معدل البقاء على قيد الحياة يرتبط عكسيا لدرجة إصابة الأعضاء خارج الكبد. لذلك، هناك حاجة إلى مزيد من البحوث، ونموذج حيواني بسيط ويمكن استنساخه مطلوب لمحاكاة IRI بعد زرع الكبد.
استنادا إلى تعريف المرحلة anhepatic، ونحن محاكاة التغيرات الديناميكية الدموية في زرع الكبد مما أدى إلى IRI من الأجهزة خارج الكبد في الفئران. هنا، نقدم وصفا مفصلا لكيفية بناء نموذج حيواني للمرحلة anhepatic (نقص التروية الكبد) في الفئران لتسهيل البحوث الأساسية في IRI بعد زرع الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان على تجربة جامعة قوانغشي الطبية (No20190920). تم تزويد جميع الحيوانات من قبل مركز التجارب الحيوانية في جامعة قوانغشى الطبية. استخدمنا SPF الذكور Sprague الفئران داولي (200-250 غرام، 10-12 أسابيع)، أبقى تحت درجة حرارة الغرفة من 25 ± 2 درجة مئوية والرطوبة من 50 ± 10٪. تم إيقاف التغذية قبل 24 ساعة من العملية؛ ومع ذلك، تم توفير المياه.
ملاحظة: يمكن لمشغل واحد إجراء جميع العمليات دون أساس الجراحة المجهرية أو المجهر الجراحي.
1. العملية
- بعد وزنها، تخدير الفئران مع ايزوفلوران (5٪). باستخدام آلة تخدير.
- بعد 1-2 دقيقة، المشبك بلطف أصابع الجرذ مع ملاقط. إذا لم يستجب الجرذ بعد الضغط ، فقد دخل حالة تخدير. استخدام مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع جفاف. استخدام مصابيح التدفئة الحيوانية للحفاظ على درجة حرارة جسم الفئران في 37-38 درجة مئوية.
- بعد تطهير البطن (povidone اليود الحل) ، وإصلاح الفئران على طاولة تشريح الحيوان. جعل شق متوسط 3 سم تحت عملية xiphoid باستخدام ملقط ومقص.
- افتح تجويف البطن، وفضح الكبد باستخدام الداخر، وتعبئة الرباط الكبدي. استخدام مسحات القطن لقلب الفص الأوسط للكبد بلطف وتحويلها إلى أعلى لفضح الـ بورتا هيباتيس. تحديد اتفاقية التنوع البيولوجي، الكهروضوئية، والهايّة.
- ادفع الأمعاء الدقيقة نحو تجويف البطن السفلي الأيسر باستخدام مسحات القطن، واغطيه بالشاش الرطب، واحرك الوريد الوريدي الوريدي داخل الجسم إلى الوريد الكلوي الأيمن.
- عزل الوريد المدخل، الشريان الكبدي، والكافا الوريدية السفلية فوق الوريد الكلوي الأيمن مع عدسة داخل العين واللليبات ملحوظ مع 3-0 خيط حرير، مع كل عقدة زلة.
- قطع فتح الجلد السفلي السفلي الأيسر والأيمن وفضح الوريد الفخذي باستخدام ملقط العيون. حقن ببطء منخفض الوزن الجزيئي الهيبارين 625 وحدة دولية / كغ من خلال الوريد الفخذي ل heparinize الجسم كله.
- Ligate الوريد المدخل, الشريان الكبدي, وسفاح الوريد السفلي فوق الوريد الكلوي الأيمن مع خياطة رقم 3-0, دائم 45 دقيقة (الشكل 1). استبدل الأمعاء الدقيقة في تجويف البطن واغطيها بالشاش. تقليل التخدير الاستنشاقي خلال هذه الفترات.
- بعد 45 دقيقة، حرر الوريد المدخل، الشريان الكبدي، والكافا السفلية فوق الوريد الكلوي الأيمن.
- خياطة العضلات والجلد، طبقة بطبقة، وإنهاء التخدير الاستنشاقي. توفير الانسداد بعد الجراحة باستخدام المورفين تحت الجلد من 5 ملغ / كغ كل 4 ساعات.
- مراقبة الفئران حتى يكون مستيقظا ويتغذى تحت درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية والرطوبة من 50 ± 10٪. مصابيح تدفئة الحيوانات ضرورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الجرذان' التسامح إلى نقص التروية الكبد
في هذا النموذج الحيواني، تظهر المواقع التي تم ربط الأوعية الدموية فيها أثناء التشغيل في الشكل 1. تم تقسيم الجرذان بشكل عشوائي إلى 5 مجموعات لـ ISCHEMIA لمدة 15 دقيقة (مجموعة I15) و30 دقيقة (مجموعة I30) و45 دقيقة (مجموعة I45) و60 دقيقة (I60) ومجموعة صورية مع 10 فئران في كل مجموعة. وقد لوحظ معدل البقاء على قيد الحياة لكل مجموعة بعد 14 يوما من العملية. وقد نجت جميع الفئران في مجموعة I15، ومجموعة I30، ومجموعة صورية. نجا ثمانية لمدة 14 يوما في مجموعة I45، ونجا 2 فقط في مجموعة I60. وتشير هذه النتائج إلى أن الفئران يمكن أن تتسامح مع المرحلة anhepatic لمدة أقصاها 45 دقيقة(الجدول 1).
آثار الربط الوعائي على الدورة الدموية في الفئران
خلال التجربة، سجلت النظم الحيوية معدل ضربات القلب وضغط الدم (النوب الشريان السباتي الداخلي الأيمن) قبل وبعد المرحلة الأنهبي. وجدنا أن معدل ضربات القلب ومتوسط ضغط الشرايين (MAP) من الفئران تغيرت بشكل كبير بعد ربط الأوعية الدموية(الشكل 2).
الآثار على الأجهزة خارج الكبد
تم العثور على احتقان الإقفار الكبدي وذمة في الأمعاء، وفاري المعدة، وsplenomegaly بعد الربط. تم تقسيم ثمانين فئران عشوائياً إلى 8 مجموعات لاقفوية الإقفاري لمدة 45 دقيقة (T0)، وإعادة الضخ لمدة 6 ساعات (T6)، 12 ساعة (T12)، 24 ساعة (T24)، 48 ساعة (T48)، 72 ساعة (T72)، 7 أيام (D7)، و 14 يوما (D14). بعد ضحى الفئران، تم أخذ الأنسجة من الكلى والبنكرياس والأمعاء الدقيقة والقلب والرئة وملطخة بالهماوكسيلين-إيوسين (HE). تتكون عملية التلطيخ بأكملها من خمس خطوات: الندى، والتلطيخ، والجفاف، والشفافية، والختم. باستثناء القلب ، تم تعيين درجات مرضية كما سبق وصفها16،17،18،19.
الوقت حتى الحد الأقصى للإصابة بالأعضاء خارج الكبد متنوعة؛ كان بعد 6-24 ساعة من العملية في البنكرياس و 24-48 ساعة للرئتين. أصيب الجهاز المعوي والكلى بجروح بالغة بعد 45 دقيقة من نقص التروية. لم يكن هناك أي شذوذ واضح في الغشاء المخاطي المعوي بعد 24 ساعة من العملية ، وتم شفاء الكلى بعد 48 ساعة. بعد إعادة الضخ، تم العثور على نخر الخلايا عضلة القلب المحلية، وتفتيت الخلية وانحلال، وتسلل الخلايا الالتهابية، والامتدنة المحلية والازدحام في القلب من قبل 24-48 ساعة بعد العملية(الشكل 3).
الرئتين
تم العثور على تسلل العدلات في أنسجة الرئة بعد نقص التروية. مع زيادة وقت إعادة ضخ (T0, T6), مخاط من تجويف الشعب الهوائية يمكن أيضا أن ينظر في أنسجة الرئة. حدث تسلل الخلايا الالتهابية في جدار السنخي، الذي أصبح سميكًا بشدة. ويمكن أيضا أن يكون انهيار القُمَّة واختفاء تجويف السنخية موجودة في بعض الأنسجة. لم يكن هناك ذمة قُزومية كبيرة أو احتقان شعري في الجدران السنخية. وقد أصيبوا بجروح بالغة بعد 24-48 ساعة من العملية، حيث أظهرت بعض الجرذان ضيق التنفس ومظاهر أخرى بعد العملية 7 أيام. واقترح he staining النتائج التهاب الغدد الليمفاوية في مجرى الهواء, تسلل الخلايا الالتهابية خفيفة في جدار السنخي, والنزيف المحلي (الشكل 3A, الشكل 4).
الكلي
تم العثور على كمية صغيرة من مادة الحمض الخلوي في الأنابيب الكلوية بعد نقص التروية في المرحلة T0 ، ولكن لم يتم رؤية أي تسلل خلايا التهابية وتشوهات أخرى. ومع ذلك ، تورم الخلايا الظهارية أنبوبي كلوي ، المسامية أو السيتوبلازم مفتور ، والخلايا النخرية في عدد قليل من التجويف ، karyopyknosis ، والتشرذم ، وفقدان الحدود فرشاة ، ومجموعة حمضية على شكل أنبوب في العديد من lumens شوهد 6-48 ساعة بعد العملية. بالإضافة إلى ذلك ، شوهد عدد قليل من الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية مع الضمور الحبيبي ، وشوهد السيتوبلازم المسام والملطخ بخفة بعد 48 ساعة من العملية. تم العثور على التهاب الخلايا الخلالي الحادة الكبيرة ، ومع ذلك لا يوجد تسلل شديد إلى الخلايا الالتهابية (الشكل 3B، الشكل 5).
الامعاء
وكانت الأمعاء الدقيقة الأكثر إصابة بعد نقص التروية (T0). كان هناك تسلل شديد إلى الخلايا الالتهابية ، وذرف ظهارة الغشاء المخاطي ، والخلايا التيلانغية. مع زيادة وقت إعادة الضخ ، تلتئم الإصابة بسرعة. تم استعادة ظهارة المخاطية تماما بعد 24 ساعة من العملية، وشوهد فقط تسلل الخلايا الالتهابية خفيفة(الشكل 3C، الشكل 6).
البنكرياس
تسللت الخلايا الالتهابية الحادة حول أنسجة البنكرياس في المرحلة T0. ومع ذلك، فإن آفات البنكرياس لم تكن موحدة. ستة من كل 10 كان نخر البنكرياس والتسلل الالتهابي 24 ساعة بعد الجراحة، و4 الآخرين لم يكن لديهم تشوهات واضحة. بعد 24 ساعة من العملية ، بالإضافة إلى تسلل الخلايا الالتهابية ، كان هناك وذمة ، وتوسيع الفضاء بين الفقار ، والنزيف ، ونخر عدد صغير من خلايا الأسيني ، وعدم وضوح ترسيم الخلايا ، والتفتت النووي والتفكك ، وتسلل الخلايا الالتهابية الخفيفة في المجال البصري. ثم اختفى الالتهاب ببطء(الشكل 3D، الشكل 7).
القلب
بحلول المرحلة T0 ، تم ترتيب myocytes القلبية بانتظام مع ترسيم واضح ، مورفولوجيا الخلايا الطبيعية ، والاحتقان الخلالي المحلي ، وترسب صبغي بني أصفر معتدل. وعلاوة على ذلك ، لوحظ تسلل الخلايا الالتهابية في المناطق الخلالية وغدد القلب. مع زيادة في وقت إعادة ضخ، تم العثور على نخر الخلايا عضلة القلب المحلية، وتفتيت الخلايا وانحلال، وتسلل الخلايا الالتهابية، والاضيق الوعائي المحلي، والازدحام في الأنسجة 24-48 ساعة بعد العملية. كما شوهد في بعض العينات توسيع البطين، وبنية مسامية، وزيادة عضلة القلب بينية القلب، وتسلل الخلايا الالتهابية الخفيفة. بعد 48 ساعة ، اختفت خلايا القلب المحلية واستبدلت بكمية صغيرة من النسيج الضام الليفي مع تسلل خلايا التهابية خفيفة. بحلول ذلك الوقت، لم تشاهد أي تشوهات واضحة أخرى(الشكل 8).
آثار التغيرات الديناميكية الدموية على الكبد والكلى والبنكرياس وفهارس مصل القلب
تم جمع المصل، وتم الكشف عن مستويات الأمينية ألانين (ALT)، aspartate aminotransferase (AST)، الكريلينين، والأميليز من قبل محلل الكيمياء الحيوية التلقائي. بلغت جميع المؤشرات ذروتها في 24-48 ساعة ، على عكس التغيرات المرضية. على الرغم من أن هذه المستويات كانت طبيعية بعد 48 ساعة من العملية ، استمر الضرر المرضي(الشكل 9).
الشكل 1: موقع الرباط: PV, HA, IVC العلوي من الوريد الكلوي الأيمن.
| مجموعه | ن | البقاء على قيد الحياة في 24 ساعة، ن (٪) | البقاء على قيد الحياة عند 7 د، ن (٪) | البقاء على قيد الحياة عند 14 d, n (٪) |
| الشام | 10 | 10 | — | — |
| أنا 15 دقيقة | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| أنا 30 دقيقة | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| أنا 45 دقيقة | 10 | 8/10 | 8/10 (80) | 8/10 (80) |
| أنا 60 دقيقة | 10 | 2/10 | 2/10 (20) | 2/10 (20) |
الجدول 1: تحمل الجرذان لـ نقص التروية في الكبد
الشكل 2: التغيرات الديناميكية الدموية في I45 دقيقة المجموعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عشرات من الأنسجة الجهاز. (A) الرئة; (ب) الكلى; (C) الأمعاء; (د) البنكرياس; * ذات دلالة إحصائية مقارنة بمجموعة الصور(P < 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التغيرات المرضية في الرئتين بعد العملية. (أ) مجموعة الشام؛ (B) مجموعة Ischemia (مجموعة T0)؛ (ج)إعادة ضخ 6 ساعات (T6) مجموعة؛ (د)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (E)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (واو)إعادة ضخ 24 ساعة (T24) مجموعة؛ (G)إعادة ضخ 48 ساعة (T48) مجموعة؛ (حاء)Reperfusion 7 أيام (D7) مجموعة؛ (I) Reperfusion 14 يوما (D14) مجموعة (مقياس 50 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التغيرات المرضية في الكلى بعد العملية. (أ)مجموعة الشام؛ (B) مجموعة Ischemia (مجموعة T0)؛ (ج)إعادة ضخ 6 ساعات (T6) مجموعة؛ (د)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (E)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (واو)إعادة ضخ 24 ساعة (T24) مجموعة؛ (G)إعادة ضخ 48 ساعة (T48) مجموعة؛ (حاء)Reperfusion 7 أيام (D7) مجموعة؛ (I) Reperfusion 14 يوما (D14) مجموعة (مقياس 50 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التغيرات المرضية في الأمعاء الدقيقة بعد العملية. (A) مجموعة الشام ؛ (B) مجموعة Ischemia (مجموعة T0)؛ (ج)إعادة ضخ 6 ساعات (T6) مجموعة؛ (د)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (E)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (واو)إعادة ضخ 24 ساعة (T24) مجموعة؛ (G)إعادة ضخ 48 ساعة (T48) مجموعة؛ (حاء)Reperfusion 7 أيام (D7) مجموعة؛ (I) Reperfusion 14 يوما (D14) مجموعة (مقياس 50 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: التغيرات المرضية في البنكرياس بعد العملية. (أ) مجموعة الشام ؛ (B) مجموعة Ischemia (مجموعة T0)؛ (ج)إعادة ضخ 6 ساعات (T6) مجموعة؛ (د)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (E)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (واو)إعادة ضخ 24 ساعة (T24) مجموعة؛ (G)إعادة ضخ 48 ساعة (T48) مجموعة؛ (حاء)Reperfusion 7 أيام (D7) مجموعة؛ (1)إعادة ضخ 14 يوما (D14) مجموعة (A و D مقياس 50 ميكرومتر ؛ مقياس BCEFGHI 50 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التغيرات المرضية في القلب بعد العملية. (أ) مجموعة الشام؛ (B) مجموعة Ischemia (مجموعة T0)؛ (ج)إعادة ضخ 6 ساعات (T6) مجموعة؛ (د)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (E)إعادة ضخ 12 ساعة (T12) مجموعة؛ (واو)إعادة ضخ 24 ساعة (T24) مجموعة؛ (G)إعادة ضخ 48 ساعة (T48) مجموعة؛ (حاء)Reperfusion 7 أيام (D7) مجموعة؛ (1) Reperfusion 14 يوما (D14) مجموعة (مقياس 50 ميكرومتر ؛ مقياس BCDEFGHI 100 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: تغييرات ALT، AST، الكرينينين (Cr) و amylase في كل مجموعة; * ذات دلالة إحصائية مقارنة بمجموعة الصور(P<0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OLT في الفئران هو نموذج مثالي لدراسة الحفاظ على الأعضاء في زراعة الكبد، IRI، رفض زرع، التسامح المناعي، زرع الأمراض والصيدلة، homotransplantation، وxenotransplantation. في الوقت الحاضر، ويستخدم على نطاق واسع في البحوث التجريبية لزرع الكبد.
خلال الدراسات التجريبية قمنا أولاً بإعطاء التخدير داخل الصفاق الصوديوم الصوديوم ووجدنا أن هذا أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات بعد الجراحة والتسامح القصير مع التغيرات الديناميكية الدموية. وهكذا، استخدمنا التخدير الاستنشاقي في التجارب اللاحقة لبداية سريعة للعمل وسرعة استبعاد الخصائص في المختبر. التحول إلى التخدير استنشاق تحسنت بشكل كبير في الوقت التسامح والبقاء على قيد الحياة بعد الجراحة من الفئران. يجب على المحققين الانتباه إلى التنفس ومعدلات ضربات القلب من الفئران لمنع الإفراط في التخدير. يمكن استخدام النظم الحيوية لمراقبة معدل ضربات القلب وضغط الدم. كما لاحظنا تأثير سمك الغرز الجراحي على ربط الأوعية الدموية. على الرغم من أن خطوط أصغر من 3-0 يمكن أن ligate تماما الأوعية الدموية، كانت صعبة لتخفيف وقد يؤدي إلى تمزق الأوعية الدموية. على العكس من ذلك، قد يؤدي خطوط أكبر من 3-0 في انسداد الأوعية الدموية غير مكتملة، مما يمنع التغيرات في ديناميكية الدموية. وسيتم تحسين هذه المشاكل المادية في التجارب المستقبلية. هناك بعض القيود على بروتوكولنا. لا ينصح مصابيح الحرارة لصيانة درجة الحرارة بسبب إمكاناتها لارتفاع درجة الحرارة; اقتراحات التدفئة البديلة، مثل إعادة تدوير بطانيات المياه، ويوصى لصالح الحيوان.
هناك العديد من الأسباب لإصابة الجهاز بعد OLT. أولا، يمكن أن يكون سبب الإصابة عن طريق الحفاظ على الباردة من الكبد في المختبر20المانحة . ثانياً، يمكن أن يحدث IRI ويسبب تلف الأنسجة عندما يعود إمداد الدم إلى الأنسجة (إعادة ضخ الدم) بعد فترة طويلة من نقص التروية. الإقفاريات هي السبب الرئيسي للإصابة، والتسريب هو العملية التي تحدث فيها الإصابة. بعد منع في وقت واحد من IVC و PV خلال المرحلة anhepatic ، وقعت كمية كبيرة من ركود الدم في الأطراف السفلية والأعضاء الداخلية. وانخفض حجم التداول الفعال (ECV) بشكل حاد، وانخفض حجم الـ MAP. ومع ذلك ، بسبب تحفيز العصب المبهم ، لم يكن هناك زيادة تعويضية في معدل ضربات القلب في الفئران. في هذه التجربة، وجدنا أن الفئران خضعت لتغيرات ديناميكية دموية كبيرة في غضون 5 دقائق من الربط وإطلاق السفينة، والتي استوفت تعريف متلازمة نقص التروية-reperfusion.
الإقفاريات تحدث في بعض الأنسجة خارج الكبد. بعد المرحلة anhepatic، زيادة ECV. عادت خطة العمل إلى طبيعتها بعد أن تم إلغاء حظر IVC و PV ، مع إصابة تحدث خارج الكبد بعد إعادة ضخها. وعلاوة على ذلك، أنتجت IRI من الكبد المانح وسطاء الالتهابات (TNF-α، إنترلوكين-1، إنترلوكين-6، إنترلوكين-8) التي هاجمت الأجهزة القعدة21. في هذه التجربة ، تم محاكاة ديناميكية الدم خلال المرحلة ال hehepatic ، مما تسبب في الازدحام السلبي لـ IVC والكلى ، وتلف حاجز الجهاز الهضمي ، والتنقل البكتيري ، وهوجية الأعضاء (مثل الرئة ، القلب ، البنكرياس ، الكلى ، إلخ) حيث يقع SVC ، وIRI إلى الأعضاء الخارجية.
أظهرت النتائج المرضية أن ذروة الإصابة الإقفارية ووقت التعافي كانت مختلفة في كل عضو. على الرغم من أن التخزين البارد والأضرار الناجمة عن عوامل المناعة لا يمكن محاكاتها في هذه الدراسة ، يمكن تكرار IRI anhepatic ومقارنتها مع نماذج حيوانية أخرى للبحث عن إصابة الأعضاء خارج الجسم. يمكن مقارنة نموذجنا ونموذج OLT وملاحظة لتوفير أساس للبحث عن إصابة الأعضاء خارج الكبد. وعلاوة على ذلك، نموذجنا هو مماثل لبعض العمليات الكبد السريرية، مثل تلك التي لهيلاري cholangiocarcinoma. هيلاري cholangiocarcinoma هو ورم خبيث يغزو في كثير من الأحيان PV أو IVC وغالبا ما يتطلب لقط PV أثناء الجراحة22. تم تنفيذ إعادة بناء البوابة الكبدية؛ عندما يغزو الورم IVC ، مطلوب أيضًا لقط داخل العملية لـ IVC ، وتتسق التغييرات الديناميكية الدموية الناتجة مع نموذجنا.
لتلخيص, نموذجنا في الفئران سهل الاستخدام ومباشر, دون microsurgery, ويوفر الأساس للبحوث الأساسية في IRI من الأجهزة خارج الكبد بعد نقص التروية الكبدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى مؤلفي هذه المخطوطة أي تضارب في المصالح للكشف عنها.
Acknowledgments
ونود أن نُقرّ بالاقتراحات المفيدة التي قدمها الدكتور وين تاو لي والدكتور جي هوا وو من المستشفى الثاني التابع لجامعة غوانغشي الطبية. ويود المؤلفون أن يشكروا زملاءنا في الفريق على التعليقات والمناقشات المفيدة. كما يود المؤلفون أن يشكروا المراجعين ومحرري JoVE المجهولين على تعليقاتهم. وينبغي توجيه شكر خاص إلى والدي الدكتور يوان على دعمهما وتشجيعهما المستمرين. وقد دعم العمل مؤسسة نينغبو للعلوم الطبيعية (2014A610248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde solution | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd | P804536 | |
| air drying oven | Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd. | BPG | |
| Alanine aminotransferase (ALT)Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K235-S | |
| ammonia | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10002118 | |
| amylase Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K005-M | |
| anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 100092183 | |
| Animal anesthesia machine | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | R640 | |
| aspartate aminotransferase (AST)kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03040 | |
| automatic biochemical analyzer. | SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd. | 2400 | |
| Biosystems (when nessary) | Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd. | BL-420F | |
| Centrifuge | Baiyang Medical Instrument Co., Ltd. | BY-600A | |
| cover glass | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd | 10212432C | |
| creatinine Kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03076 | |
| dewatering machine | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Donatello Series 2 | |
| embedding machine | Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd. | KH-BL1 | |
| frozen machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| hematoxylin-eosin dye solution | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| high-efficiency paraffin wax | Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd | Q/YSQN40-91 | |
| hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10011018 | |
| intraocular lens (IOL)forceps | Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd. | JTZRN | |
| Isoflurane | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | — | |
| micro Scissors(when nessary) | Shanghai Surgical Instrument Factory | WA1010 | |
| needle holders | Shanghai Surgical Instrument Factory | J32010 | |
| neutral gum | Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd. | — | |
| normal optical microscope | Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd | Nikon Eclipse CI | |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | J3CO30 | straight |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | JD1060 | bending |
| ophthalmic Scissors | Shanghai Surgical Instrument Factory | J1E0 | |
| pathological slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| pipettes | Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd. | 7010101008 | |
| retractors | Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd. | JNT-KXQ | |
| scanner | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Pannoramic 250 | |
| slide | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G6004 | |
| xylene | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 1330-20-7 |
References
- Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
- Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
- Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
- Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
- Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
- Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
- Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
- Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
- Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
- Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
- Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933 (2018).
- Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662 (2015).
- Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
- Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
- Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
- Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
- Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818 (2019).
- Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
- Blaire, A., et al.
