Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten

Summary

Wir beschreiben eine modifizierte Agar-basierte Methode zur Quantifizierung der antimykotischen Wirkung pflanzlicher Produkte. Sowohl flüchtige als auch nichtflüchtige Beiträge zur Antimykotika-Aktivität können durch dieses Protokoll bewertet werden. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit gegen Pilze in wichtigen Entwicklungsstadien in einem einzigen Versuchsaufbau gemessen werden.

Abstract

Das beschriebene Protokoll basiert auf einer Plug-Transfer-Technik, die eine genaue Bestimmung der Mikroorganismenmengen und deren Entwicklungsstadien ermöglicht. Eine bestimmte Anzahl von Sporen wird auf einer Agarplatte verteilt. Diese Agarplatte wird für einen definierten Zeitraum inkubiert, damit die Pilze das erwartete Entwicklungsstadium erreichen können, mit Ausnahme von Sporen, bei denen keine Inkubation erforderlich ist. Agar-Stecker, die von Sporen, Hyphen oder Myzel bedeckt sind, werden als nächstes zurückgezogen und auf Agar-Medien übertragen, die die antimykotische Verbindung enthalten, die entweder in einem Abstand von den Pilzen oder in Kontakt gebracht werden soll. Dieses Verfahren ist sowohl für die Prüfung von flüssigen Extrakten als auch für feste Proben (Pulver) anwendbar. Es eignet sich besonders gut zur Quantifizierung der relativen Beiträge flüchtiger und nichtflüchtiger Wirkstoffe in bioaktiven Mischungen und zur Bestimmung ihrer Auswirkungen, insbesondere auf Sporen, frühe Hyphen und Myzel.

Das Verfahren ist für die Charakterisierung der antimykotischen Aktivität von Biokontrollprodukten, insbesondere pflanzlichen Produkten, von großer Bedeutung. Für die Pflanzenbehandlung können die Ergebnisse tatsächlich verwendet werden, um die Wahl der Art der Anwendung zu steuern und die Auslöseschwellen festzulegen.

Introduction

Globale Verluste von Obst und Gemüse können bis zu 50% der Produktion¹ erreichen und resultieren vor allem durch Lebensmittelzerfall durch Pilzverderb auf dem Feld oder während der Lagerung nach der Ernte^2,3, trotz der umfangreichen Beschäftigung von synthetischen Fungiziden seit der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts⁴. Die Verwendung dieser Stoffe wird überdacht, da sie ernste Umwelt- und Gesundheitsgefahren darstellt. Da die schädlichen Folgen ihrer Verwendung in allen Ökosystemen auftauchen und sich Hinweise auf mögliche gesundheitliche Auswirkungen angesammelt haben^5,6, werden neue Alternativen zu alten prophylaktischen Strategien für Behandlungen vor und nach der Ernte entwickelt^7,8,9. Daher ist die Herausforderung, vor der wir stehen, zweifach. Neuartige fungizide Strategien müssen erstens das Niveau der Wirksamkeit des Lebensmittelschutzes gegen Phytopathogene aufrechterhalten und gleichzeitig dazu beitragen, den ökologischen Fußabdruck landwirtschaftlicher Praktiken drastisch zu verringern. Um dieses ehrgeizige Ziel zu erreichen, werden Strategien vorgeschlagen, die von den natürlichen Abwehrmaßnahmen inspiriert sind, die in Pflanzen entwickelt wurden, da mehr als 1000 Pflanzenarten für ihre antimikrobiellen Eigenschaften hervorgehoben wurden⁸. Zum Beispiel sind Pflanzen, die natürliche Fungizide zur Bekämpfung von Phytopathogenen entwickelt haben, eine neue Ressource bei der Erforschung der Entwicklung neuer Biokontrollprodukte². Ätherische Öle sind Flaggschiff-Moleküle dieser Art. Zum Beispiel schützt Ätherisches Origanum Tomatenpflanzen vor grauer Schimmelin in den Gewächshäusern ¹⁰ und Solidago canadensis L. und Cassia ätherische Öle haben gezeigt, dass sie nachgeernteten Erdbeeren vor grauer Schimmelbildung bewahren^11,12. Diese Beispiele veranschaulichen, dass Biokontrolle und insbesondere pflanzliche Produkte eine Lösung darstellen, die biologische Wirksamkeit und ökologische Nachhaltigkeit verbindet.

Pflanzen sind daher eine wichtige Ressource von Molekülen, die für die Pflanzenschutzindustrie von potenziellem Interesse sind. Es wurde jedoch nur eine Handvoll pflanzlicher Produkte vorgeschlagen, die als Biokontrollprodukte verwendet werden sollen, obwohl sie allgemein als sicher, nicht phytotoxisch und umweltfreundlich anerkannt sind². Es wurden einige Schwierigkeiten bei der Umsetzung vom Labor auf das Feld beobachtet, wie z. B. die Wirksamkeit, die nach anwendung in vivo^2,9abnimmt. Daher wird es wichtig, die Fähigkeit von Labortests zu verbessern, um die Feldwirksamkeit besser vorherzusagen. In diesem Zusammenhang sind antimykotische Prüfmethoden für pflanzliche Produkte sowohl zur Bewertung ihrer antimykotischen Wirksamkeit als auch zur Definition ihrer optimalen Einsatzbedingungen erforderlich. Insbesondere sind Biokontrollprodukte im Allgemeinen weniger effizient als chemische Fungizide, daher ist ein besseres Verständnis ihrer Wirkungsweise wichtig, um geeignete Formulierungen vorzuschlagen, die Art der Anwendung in Bereichen zu ermitteln und zu definieren, welches Entwicklungsstadium des Erregers anfällig für das Gegenprodukt ist.

Zu den aktuellen Ansätzen, die sich mit antibakteriellen und antimykotischen Aktivitäten befassen, gehören Diffusionsmethoden wie Agar-Disk-Diffusion, Verdünnung, Bioautographie und Durchflusszytometrie.¹³. Die meisten dieser Techniken, genauer gesagt, die Standard-Antimykotika-Anfälligkeitstests – Agar-Disk-Diffusion und Verdünnungstests – sind gut für die Bewertung der antimikrobiellen Aktivität von löslichen Verbindungen auf bakteriellen und Pilzsporen in flüssigen Suspensionen geeignet.¹⁴. Diese Methoden eignen sich jedoch im Allgemeinen nicht zur Prüfung fester Verbindungen wie getrocknetes Pflanzenpulver oder zur Quantifizierung der antimykotischen Aktivität während des Myzelwachstums, da sie eine Sporenverdünnung oder Sporenausbreitung auf Agarplatten und/oder Verdünnung von Antimykotika erfordern.¹³. Bei der lebensmittelvergifteten Methode werden Agarplatten, die das Antimykotika enthalten, mit einer Scheibe mit einem Durchmesser von 5-7 mm aus einer 7-Tage alten Pilzkultur geimpft, ohne die genaue Menge des beginnenden Myzels zu berücksichtigen. Nach der Inkubation wird die antimykotische Aktivität als Prozent der radialen Wachstumshemmung bestimmt^17,18,19. Mit diesem Ansatz können wir die antimykotische Aktivität auf mycelial Wachstum bewerten. Im Gegensatz dazu wird das Agar-Verdünnungsverfahren durchgeführt, um die antimykotische Aktivität auf Sporen zu bestimmen, die direkt auf der Oberfläche der Agarplatte geimpft werden, die die antimykotischen Verbindungen enthält.^13,20,21. Diese beiden Ansätze liefern ergänzende Ergebnisse zur antimykotischen Aktivität. Dies sind jedoch zwei unabhängige Techniken, die parallel verwendet werden und keinen genauen Vergleich der relativen Wirksamkeit von Antimykotika auf Sporen und Myzel ermöglichen.^17,20,22 da sich die Menge des Beginnenden Pilzmaterials in den beiden Ansätzen unterscheidet. Darüber hinaus resultiert die antimykotische Aktivität eines pflanzlichen Produkts oft aus der Kombination von antimykotischen Molekülen, die von Pflanzen synthetisiert werden, um Krankheitserregern zu begegnen. Diese Moleküle umfassen Proteine, Peptide^23,24, und Metaboliten mit großer chemischer Vielfalt und Zugehörigkeit zu verschiedenen Klassen von Molekülen wie Polyphenole, Terpene, Alcalo-ds²⁵, Glucosinolate⁸, und Organosulfur Verbindungen²⁶. Einige dieser Moleküle sind flüchtig oder werden während des Erregerangriffs flüchtig²⁷. Bei diesen Wirkstoffen handelt es sich meist um schlecht wasserlösliche und hochdampfbelastete Verbindungen, die durch Wasserdestillation als ätherische Öle zurückgewonnen werden müssen.²⁸. Vapor-Phase vermittelte Anfälligkeits-Assays wurden entwickelt, um die antimikrobielle Aktivität flüchtiger Verbindungen nach Verdampfung und Migration über die Dampfphase zu messen²⁹. Diese Methoden basieren auf der Einführung antimykotischer Verbindungen in einer Entfernung von der mikrobiellen^{29,30,31,32,33}. Im häufig verwendeten Dampfphasen-Agar-Assay werden ätherische Öle auf einer Papierscheibe abgelagert und in der Mitte der Abdeckung der Petrischale in der Entfernung von der bakteriellen oder Pilzsporensuspension platziert, die auf Agarmedium verteilt wird. Der Durchmesser der Wachstumshemmungszone wird dann auf die gleiche Weise gemessen wie bei der Agar-Disk-Diffusionsmethode^20,24. Es wurden weitere Ansätze entwickelt, um die quantitative Messung der Antimykotika-Empfindlichkeit von ätherischen Ölen in der Dampfphase zu ermöglichen, die aus der Brüroth-Verdünnungsmethode abgeleitet wurde, aus der eine hemmende, dampfphasenvermittelte antimikrobielle Aktivität berechnet wurde.³², oder abgeleitet von Agar-Disk Diffusions-Assays³¹. Diese Methoden sind im Allgemeinen spezifisch für Dampfphasenaktivitätsstudien und nicht geeignet für Kontaktinhibitionstests. Dies schließt die Bestimmung des relativen Beitrags flüchtiger und nichtflüchtiger Wirkstoffe zur antimykotischen Aktivität eines komplexen bioaktiven Gemischs aus.

Die von uns entwickelte quantitative Methode zielt darauf ab, die antimykotische Wirkung von getrocknetem Pflanzenpulver auf kontrollierte Sporenmengen und angebautes Myzel, das auf der Oberfläche eines Agarmediums abgelagert wird, zu messen, um das Luftwachstum von Phytopathogenen während der Infektion der Pflanzen¹⁵ sowie eines miteinander verbundenen Myzelnetzes¹⁶zu reproduzieren. Der Ansatz ist ein modifiziertes Versuchsgebild, das auf den Agar-Verdünnungs- und Lebensmittel-vergifteten Methoden basiert, die auch im gleichen Versuchsaufbau eine nebeneinander-bezogene Quantifizierung des Beitrags sowohl flüchtiger als auch nichtflüchtiger antimykogaler Metaboliten ermöglicht. In dieser Studie wurde die Methode mit der Aktivität von drei gut charakterisierten Antimykotika gemessen.

Protocol

1. Inocula-Vorbereitung Vor dem Experiment lagen 5 L Trichoderma spp. SBT10-2018 Sporen bei 4 °C auf Kartoffeldextrose Agar Medium (PDA) gelagert und inkubieren für 4 Tage bei 30°C mit regelmäßiger Lichtexposition zur Förderung der Konidienbildung42 (Abbildung 1, Panel A).HINWEIS: Trichoderma spp. SBT10-2018 wurde aus Holz isoliert und wird als Modell in dieser Studie für sein schnelles Wachstum und die einfache Erholung der Spor…

Representative Results

Um die Fähigkeit der quantitativen Methode zu bewerten, die Wirkungsweise verschiedener Arten von Antimykotika zu unterscheiden, haben wir die Wirksamkeit von drei bekannten Antimykotika verglichen. Carbendazim ist ein nichtflüchtiges synthetisches Fungizid, das weit verbreitet ist, um eine breite Palette von Pilzerkrankungen in Pflanzen zu kontrollieren39,40. Thymus vulgaris ätherisches Öl wurde weitgehend für seine antibakterielle und antimykotisc…

Discussion

Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht die Bewertung der antimykotischen Eigenschaften von minimal verarbeiteten pflanzlichen Produkten. In diesem Protokoll wird eine homogene Verteilung der Sporen auf der Agaroberfläche mit 2 mm Glasperlen erreicht. Dieser Schritt erfordert Handhabung fähigkeiten, um richtig die Perlen zu verteilen und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, letztlich ermöglicht den Vergleich von antimykotischen Wirkungen in verschiedenen Stadien des Pilzwachstums. Wir fanden heraus, dass 5 mm Glas…

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/