Biyokontrol Ürünlerin Uçucu ve Uçucu Olmayan Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi
Summary
Bitki türevi ürünlerin antifungal etkilerini ölçmek için tasarlanmış modifiye edilmiş bir agar bazlı yöntemi açıklıyoruz. Antifungal aktiviteye hem uçucu hem de uçucu olmayan katkılar bu protokol ile değerlendirilebilir. Ek olarak, mantarlara karşı etkinlik tek bir deneysel kurulumda önemli gelişim aşamalarında ölçülebilir.
Abstract
Açıklanan protokol, mikroorganizma miktarlarının ve gelişim aşamalarının doğru belirlenmesini sağlayan bir tak-transfer tekniğine dayanmaktadır. Belirtilen sayıda spor bir agar tabağına yayılır. Bu agar plakası, inkübasyonun gerekli olmadığı sporlar dışında mantarların beklenen gelişim aşamasına ulaşmasını sağlamak için belirli bir süre kuluçkaya yatırılır. Sporlar, hyphae veya miselyum ile kaplı agar fişleri daha sonra çekilir ve mantarlardan uzak bir yere veya temas halinde test edilecek antifungal bileşiği içeren agar ortamına aktarılır. Bu yöntem hem sıvı özleri hem de katı numuneleri (tozları) test etmek için geçerlidir. Özellikle uçucu ve uçucu olmayan ajanların biyoaktif karışımlardaki göreceli katkılarını ölçmek ve özellikle sporlar, erken hyphae ve miselyum üzerindeki etkilerini belirlemek için çok uygundur.
Yöntem, biyokontrol ürünlerin, özellikle bitki kaynaklı ürünlerin antifungal aktivitesinin karakterizasyonu için son derece önemlidir. Gerçekten de, bitki tedavisi için, sonuçlar uygulama modu seçimine rehberlik etmek ve tetik eşiklerini belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
Küresel meyve ve sebze kayıpları üretimin% 50’sine kadar ulaşabilir1 ve çoğunlukla tarlada veya hasat sonrası depolama sırasında mantar bozulmasının neden olduğu gıda çürümesinden kaynaklanabilir2,3, yirminci yüzyılın ortalarından bu yana sentetik mantar öldürücülerin kapsamlı istihdamına rağmen4. Bu maddelerin kullanımı, ciddi çevresel ve sağlık tehlikelerini temsil ettiği için yeniden gözden geçiriliyor. Kullanımlarının zararlı sonuçları ekosistemler boyunca ortaya çıktıkça ve potansiyel sağlık etkilerinin kanıtları biriktiğinden5,6, hasat öncesi ve sonrası tedaviler için eski profilaktik stratejilere yeni alternatifler geliştirilmektedir7,8,9. Bu yüzden karşılaştığımız zorluk ikiye katlanıyor. Yeni mantar öldürücü stratejiler, öncelikle fitopatojenlere karşı gıda korumanın etkinlik düzeylerini korumalı ve ikinci olarak, tarım uygulamalarının çevresel ayak izini önemli ölçüde azaltmaya katkıda bulunmalıdır. Bu iddialı hedefi gerçekleştirmek için, antimikrobiyal özellikleri için 1000’den fazla bitki türü vurgulandığı için bitkilerde geliştirilen doğal savunmalardan ilham alan stratejiler önerilmektedir8. Örneğin, fitopatojenlerle savaşmak için doğal mantar öldürücüler geliştiren bitkiler, yeni biyokontrol ürünlerinin geliştirilmesini keşfetmek için yeni bir kaynaktır2. Uçucu yağlar bu tür amiral gemisi molekülleridir. Örneğin, Origanum esansiyel yağı domates bitkilerini seralarda gri küfe karşı korur 10 ve Solidago canadensis L. ve cassia esansiyel yağlarının hasat sonrası çilekleri gri küf hasarından koruduğu gösterilmiştir11,12. Bu örnekler, biyokontrol ve özellikle bitki kaynaklı ürünlerin biyolojik etkinlik ve çevresel sürdürülebilirliği birleştiren bir çözümü temsil ettiğini göstermektedir.
Bu nedenle, bitkiler mahsul koruma endüstrisi için potansiyel ilgi alanı olan moleküllerin önemli bir kaynağıdır. Bununla birlikte, genellikle güvenli, fitotoksik olmayan ve çevre dostu olarak kabul edilseler de biyokontrol ürünleri olarak kullanılmak üzere sadece bir avuç bitki ürünü önerilmiştir2. Laboratuvardan alana transpozisyonda, in vivo2,9’dauygulandıktan sonra etkinliğin azalması gibi bazı zorluklar gözlenmiştir. Bu nedenle, laboratuvar testlerinin alan etkinliğini daha iyi tahmin etme yeteneğini geliştirmek önemli hale gelir. Bu bağlamda, bitki kaynaklı ürünler için antifungal test yöntemleri hem antifungal etkinliklerini değerlendirmek hem de kullanım için en uygun koşullarını tanımlamak için gereklidir. Özellikle, biyokontrol ürünleri genellikle kimyasal mantar öldürücülerden daha az verimlidir, bu nedenle uygun formülasyonlar önermek, alanlardaki uygulama modunu tanımlamak ve patojenin hangi gelişim aşamasının aday biyoproduct’a karşı savunmasız olduğunu tanımlamak için eylem modlarının daha iyi anlaşılması önemlidir.
Antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri ele alan güncel yaklaşımlar arasında agar-disk difüzyonu, seyreltme, biyoautografi ve akış sitometrisi gibi difüzyon yöntemleri yer almaktadır.13. Bu tekniklerin çoğu ve daha spesifik olarak, standart antifungal duyarlılık testi – agar-disk difüzyon ve seyreltme tahlilleri – sıvı süspansiyonlardaki bakteriyel ve mantar sporları üzerindeki çözünür bileşiklerin antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için iyi uyarlanmıştır.14. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle kurutulmuş bitki tozu gibi katı bileşiklerin test etmek veya miselyum büyümesi sırasında antifungal aktiviteyi ölçmek için uygun değildir, çünkü agar plakalarına yayılan spor seyreltme veya spor ve/ veya antifungal bileşiklerin seyreltilmesini gerektirirler.13. Gıdadan zehirlenen yöntemde, antifungal ajanı içeren agar plakaları, miselyuma başlamanın kesin miktarı dikkate alınmadan 7 günlük bir mantar kültüründen örneklenen 5-7 mm çapında bir diskle aşılanır. İnkübasyondan sonra, antifungal aktivite radyal büyüme inhibisyonunun bir yüzdesi olarak belirlenir.17,18,19. Bu yaklaşımla misel büyümesi üzerindeki antifungal aktiviteyi değerlendirebiliriz. Buna karşılık, agar seyreltme yöntemi, antifungal bileşikleri içeren agar plakasının yüzeyine doğrudan aşılanan sporlar üzerindeki antifungal aktiviteyi belirlemek için gerçekleştirilir.13,20,21. Bu iki yaklaşım antifungal aktivite üzerinde tamamlayıcı sonuçlar verir. Bununla birlikte, antifungal bileşiklerin sporlar ve miselyum üzerindeki göreceli etkinliğinin doğru bir şekilde yan yana karşılaştırılmasını sağlamayan paralel olarak kullanılan iki bağımsız tekniktir.17,20,22 başlangıç mantar malzemesi miktarı iki yaklaşımda farklılık gösterir. Ayrıca, bitki türevi bir ürünün antifungal aktivitesi genellikle bitkiler tarafından sentezlenen antifungal moleküllerin patojenlerle yüzleşmek için birleştirilmesinden kaynaklanır. Bu moleküller proteinleri, peptitleri kapsar23,24ve polifenoller, terpenler, alcaloïds gibi farklı molekül sınıflarına ait ve geniş kimyasal çeşitliliğe sahip metabolitler25, glukozinolatlar8ve organosülfur bileşikleri26. Bu moleküllerin bazıları patojen saldırısı sırasında uçucudur veya uçucu hale gelir27. Bu ajanlar genellikle, bazıları antimikrobiyal faaliyetleri iyi kurulmuş olan uçucu yağlar olarak su damıtma yoluyla geri kazanılması gereken zayıf suda çözünür ve yüksek buhar basınçlı bileşiklerdir.28. Buhar fazı ile buharlaşma ve göçten sonra uçucu bileşiklerin antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için buhar fazı aracılı duyarlılık tahlilleri geliştirilmiştir.29. Bu yöntemler, mikrobiyal kültürden uzak bir mesafede antifungal bileşiklerin tanıtılmasına dayanmaktadır.29,30,31,32,33. Yaygın olarak kullanılan buhar fazlı agar tahlilinde, uçucu yağlar bir kağıt diske biriktirilir ve agar ortamına yayılan bakteriyel veya mantar sporları süspansiyonundan uzakta Petri kabının kapağının ortasına yerleştirilir. Büyüme inhibisyon bölgesinin çapı daha sonra agar-disk difüzyon yöntemi ile aynı şekilde ölçülür.20,24. İnhibitör buhar faz aracılı antimikrobiyal aktivitenin hesap edildiği et suyu seyreltme yönteminden elde edilen esansiyel yağların buhar fazı antifungal duyarlılığının nicel ölçümünü sağlamak için başka yaklaşımlar geliştirilmiştir.32veya agar-disk difüzyon testlerinden türetilmiştir31. Bu yöntemler genellikle buhar fazı aktivite çalışmalarına özgüdür ve temas-inhibisyon testlerine uygun değil. Bu, uçucu ve uçucu olmayan ajanların karmaşık bir biyoaktif karışımın antifungal aktivitesine göreceli katkısının belirlenmesini önler.
Geliştirdiğimiz nicel yöntem, kurutulmuş bitki tozunun kontrollü miktarlarda sporlar üzerindeki antifungal etkisini ölçmeyi amaçlamaktadır ve bitkilerin enfeksiyonu sırasında fitopatojenlerin havadan büyümesini çoğaltmak için bir agar ortamının yüzeyinde biriken miselyum15 ve birbirine bağlı bir misel ağı16. Yaklaşım, aynı deneysel kurulumda hem uçucu hem de uçucu olmayan antifungal metabolitlerin katkısının yan yana ölçülmesine izin veren agar seyreltme ve gıdadan zehirlenmiş yöntemlere dayanan değiştirilmiş bir deneysel kurulumdur. Bu çalışmada, yöntem iyi karakterize edilmiş üç antifungal preparatın aktivitesi ile karşıttır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yaklaşım, minimum işlenmiş bitki türevi ürünlerin antifungal özelliklerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu protokolde, agar yüzeyindeki sporların homojen dağılımı 2 mm cam boncuk kullanılarak elde edilir. Bu adım, boncukları düzgün bir şekilde dağıtmak ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için elleçleme becerilerini gerektirir ve sonuçta mantar büyümesinin farklı aşamalarında antifungal etkilerin karşılaştırılmasına izin verir. Yayılma sırasında homojenizasyon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Değerli tavsiyeleri için Frank Yates’e minnettarız. Bu çalışma Sup’Biotech tarafından desteklendi.
Materials
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 – 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 – 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 – 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste – Extent, causes and prevention. FAO. , (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T. A Short History of Fungicides. APSnet Feature Articles. (1755), 1-12 (2008).
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, &. #. 3. 5. 0. ;., Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method – “SPOTi” for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H. Antimicrobial properties of allium species. Current Opinion in Biotechnology. 23 (2), 142-147 (2012).
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
