바이오 제어 제품의 휘발성 및 비휘발성 항진균 활성 측정
Summary
식물 유래 제품의 항진균 효과를 정량화하도록 설계된 수정된 한천 기반 방법을 설명합니다. 항진균 활성에 대한 휘발성 및 비휘발성 기여는 모두 이 프로토콜을 통해 평가될 수 있다. 또한, 곰팡이에 대한 효능은 단일 실험 설정에서 주요 발달 단계에서 측정될 수 있다.
Abstract
설명된 프로토콜은 미생물 수량 및 발달 단계를 정확하게 판단할 수 있는 플러그 전달 기술을 기반으로 합니다. 지정된 수의 포자가 한천 판에 퍼져 있습니다. 이 한천판은 배양이 필요하지 않은 포자를 제외한 곰팡이가 예상되는 발달 단계에 도달할 수 있도록 정의된 기간 동안 배양됩니다. 포자, 최면 또는 균사체로 덮인 한천 플러그는 다음 철회하고 항진균 화합물을 함유한 천매체로 이송되어 곰팡이로부터 멀리 또는 접촉하여 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 액체 추출물과 고체 샘플(분말)을 모두 테스트하는 데 적용됩니다. 특히 포자, 조기 최면 및 균사체에 대한 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여를 정량화하고 그 효과를 결정하는 데 특히 적합합니다.
이 방법은 바이오 제어 제품, 특히 식물 유래 제품의 항진균 활성의 특성화와 매우 관련이 있습니다. 실제로, 식물 처리를 위해, 결과는 응용 프로그램의 모드의 선택을 안내하고 트리거 임계 값을 설정하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
과일과 채소의 글로벌 손실은 생산1의 50 %까지 도달 할 수 있으며 주로 20세기중반 부터 합성 살균제의 광범위한 고용에도 불구하고, 필드 또는 수확 후 저장2,3동안 곰팡이 부패로 인한 식품 부패로 인해 발생할 수 있습니다. 이 물질의 사용은 심각한 환경 및 건강 위험을 나타내기 때문에 재검토되고있다. 이들의 유해한 결과가 생태계 전반에 걸쳐 나타나고 잠재적 건강 영향의증거가 축적됨에 따라5,6,수확 후 치료 전 및 후 예방 전략에 대한 새로운 대안이 개발되고 있다7,8,9. 따라서 우리가 직면하는 도전은 두 배입니다. 새로운 살균 전략은 첫째, 식물 병원균에 대한 식품 보호의 효능 수준을 유지하고 두 번째로 농업 관행의 환경 발자국을 획기적으로 줄이는 데 기여해야합니다. 이 야심찬 목표를 달성하기 위해 식물에서 진화한 자연 방어에서 영감을 얻은 전략은 1000종 이상의 식물종이 항균성질8을강조함에 따라 제안되고 있다. 예를 들어, 식물병원균과 싸우기 위해 천연 살균제를 개발한 식물은 새로운 생물통제 제품2의개발을 탐구하는 새로운 자원이다. 에센셜 오일은 이 유형의 주력 분자입니다. 예를 들어, 오리가눔 에센셜 오일은 온실 10의 회색 곰팡이로부터 토마토 식물을 보호하고, Solidago canadensis L. 및 cassia 에센셜 오일은 수확 후 딸기를 회색 곰팡이 손상11,12로부터보존하는 것으로 나타났다. 이러한 예는 생물 통제와 특히 식물 유래 제품이 생물학적 효능과 환경 지속 가능성을 결합한 솔루션을 나타낸다는 것을 보여줍니다.
따라서, 식물은 작물 보호 산업에 대 한 잠재적인 관심의 분자의 중요 한 자원. 그러나 소수의 식물 제품만이 일반적으로 안전, 비식물독성 및 친환경2로인식되더라도 생물 통제 제품으로 사용할 것을 제안되었습니다. 실험실에서 현장으로의 전치에 대한 몇 가지 어려움이 관찰되었으며, 예컨대 생체 내적용2,9에적용된 효능감소 등이 관찰되었다. 따라서, 더 나은 필드 효능을 예측하는 실험실 테스트의 능력을 개선하는 것이 중요해진다. 이러한 맥락에서 식물 유래 제품에 대한 항진균 검사 방법은 항진균 효능을 평가하고 사용하기 위한 최적의 조건을 정의하는 데 모두 필요합니다. 구체적으로, 바이오컨트롤 제품은 일반적으로 화학 살균제보다 효율이 낮기 때문에, 그들의 행동 모드를 더 잘 이해하는 것이 적합한 제형을 제안하고, 분야에서 적용 모드를 식별하고, 병원균의 발달 단계가 후보 바이오제품에 취약한지를 정의하는 것이 중요하다.
항균 및 항진균 활동을 해결하는 현재 접근법은 한천 디스크 확산, 희석, 생물학적 소학 및 유동 세포측정과 같은 확산 방법을 포함합니다.13. 이러한 기술의 대부분, 그리고 더 구체적으로, 표준 항진균 감수성 테스트 – agar 디스크 확산 및 희석 작용 – 액체 현탁액에서 세균성 및 곰팡이 포자에 용해 화합물의 항균 활성을 평가하기위한 잘 적응된다14. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 건조 된 식물 분말 과 같은 고체 화합물을 테스트하거나 천판에 포자 희석 또는 포자 확산 및 /또는 항진균 화합물의 희석을 필요로하기 때문에 균사 체 성장 중 항진균 활성을 정량화하는 데 적합하지 않습니다.13. 식품 독방법에서 항진균제를 함유한 한천판은 정확한 양의 시동을 고려하지 않고 7일 된 곰팡이 배양에서 샘플링된 5-7mm 직경 디스크로 접종된다. 인큐베이션 후 항진균 활성은 방사형 성장 억제의 백분율로 결정됩니다.17,18,19. 이 접근으로 우리는 근생 성장에 항진균 활동을 평가할 수 있습니다. 대조적으로, agar 희석 방법은 항진균 화합물을 함유하는 천판의 표면에 직접 접종된 포자에 대한 항진균 활성을 결정하기 위해 수행됩니다.13,20,21. 이 두 가지 방법은 항진균 활성에 대한 보완적인 결과를 제공합니다. 그러나 이들은 포자와 균사체에 항진균 화합물의 상대적 효능의 정확한 나란히 비교를 제공하지 않는 병렬로 사용되는 두 개의 독립적 인 기술입니다17,20,22 곰팡이 재료의 시작량이 두 가지 접근 방식에서 다릅니다. 더욱이, 식물 유래 제품의 항진균 활성은 종종 식물에 의해 합성된 항진균 분자의 조합으로부터 병원균을 마주하게 된다. 이 분자는 단백질, 펩티드를 포함합니다23,24, 및 대사 산물은 광범위한 화학적 다양성을 가지며 폴리페놀, 테르펜, 알칼로이드와 같은 다양한 분자 클래스에 속하는 대사산물25, 글루코시올레이트8및 유기황 화합물26. 이들 분자 중 일부는 불안정하거나 병원균 공격 중 휘발성이 됩니다.27. 이 에이전트는 가장 자주 가난한 수용성 및 에센셜 오일로 물 증류를 통해 복구 해야 하는 높은 증기 압력 화합물, 그 중 일부는 잘 설립 되었습니다.28. 증기상 매개 감수성 감수성 작용은 증기상을 통한 증발 및 이동에 따른 휘발성 화합물의 항균 활성을 측정하기 위해 개발되었습니다.29. 이러한 방법은 미생물 배양으로부터 멀리 떨어진 항진균 화합물의 도입에 기초한다.29,30,31,32,33. 일반적으로 사용되는 증기상 한고 분석에서 에센셜 오일은 종이 디스크에 증착되어 포이 배지에 퍼지는 세균또는 곰팡이 포자 현탁액과 멀리 떨어진 페트리 접시의 표지 중앙에 배치됩니다. 성장 억제 영역의 직경은 다음 한천 디스크 확산 방법에 대한 것과 같은 방식으로 측정됩니다.20,24. 다른 접근법은 억제 증기상 매개 항균 활성을 계산한 국물 희석 법에서 유래된 에센셜 오일의 증기상 항진균 감수성의 정량적 측정을 제공하기 위해 개발되었습니다.32또는 한천 디스크 확산 소집에서 파생31. 이러한 방법은 일반적으로 증기상 활성 연구에 특이적이며 접촉 억제 작용에 적합하지 않습니다. 이는 복잡한 생리활성 혼합물의 항진균 활성에 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여의 결정을 배제한다.
우리가 개발한 정량적 방법은 식물15의 감염 시 식물병원균의 공중 성장을 재현하기 위해 천 배지의 표면에 증착된 포자와 재배 된 균사체의 제어량에 대한 건조 식물 분말의 항진균 효과를 측정하는 것을 목표로하고 있으며, 상호 연결된 균사네트워크(16). 접근방식은 동일한 실험 설정에서 휘발성 및 비 휘발성 항진균 대사 산물의 기여도를 나란히 정량화할 수 있는 agar 희석 및 식품 중독 방법에 기초한 변형된 실험 용 설정이다. 이 연구에서는, 이 방법은 잘 특징인 3개의 항진균 제제의 활동에 대하여 벤치마킹되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시 된 접근 방식은 최소 가공 식물 유래 제품의 항진균 특성의 평가를 허용합니다. 이 프로토콜에서는 2mm 유리 구슬을 사용하여 천 표면에 포자의 균일한 분포가 달성된다. 이 단계는 제대로 구슬을 배포하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 처리 기술을 필요로, 궁극적으로 곰팡이 성장의 다른 단계에서 항진균 효과의 비교를 허용. 우리는 확산 하는 동안 균질화 하는 동안 5 mm 유리 구슬 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
프랭크 예이츠의 소중한 조언에 감사드립니다. 이 작품은 Sup’Biotech에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 – 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 – 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 – 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
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