जैव नियंत्रण उत्पादों की अस्थिर और गैर-अस्थिर एंटीफंगल गतिविधि को मापना
Summary
हम पौधे से व्युत्पन्न उत्पादों के एंटीफंगल प्रभावों की मात्रा निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन की गई एक संशोधित आगर-आधारित विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के माध्यम से एंटीफंगल गतिविधि में अस्थिर और गैर-अस्थिर योगदान दोनों का आकलन किया जा सकता है। इसके अलावा, कवक के खिलाफ प्रभावकारिता एक ही प्रयोगात्मक सेटअप में प्रमुख विकासात्मक चरणों में मापा जा सकता है।
Abstract
वर्णित प्रोटोकॉल एक प्लग-ट्रांसफर तकनीक पर आधारित है जो सूक्ष्मजीव मात्रा और उनके विकास के चरणों के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। एक आगार प्लेट पर एक निर्दिष्ट संख्या में बीजाणु फैले होते हैं। इस आगर प्लेट को एक निर्धारित अवधि के लिए इनक्यूबेटेड किया जाता है ताकि कवक को अपेक्षित विकासात्मक चरण तक पहुंचने की अनुमति दी जा सके, सिवाय बीजाणुओं को छोड़कर जहां इनक्यूबेशन की आवश्यकता नहीं है। बीजाणुओं, हाइफे, या माइसेलियम द्वारा कवर किए गए एगर प्लग को अगले वापस ले लिया जाता है और एंटीफंगल यौगिक वाले एगर मीडिया पर स्थानांतरित किया जाता है जिसका परीक्षण या तो कवक से दूरी पर या संपर्क में रखा जाता है। यह विधि तरल अर्क और ठोस नमूनों (पाउडर) दोनों का परीक्षण करने के लिए लागू होती है। यह विशेष रूप से जैव सक्रिय मिश्रण में अस्थिर और गैर-अस्थिर एजेंटों के सापेक्ष योगदान को निर्धारित करने और उनके प्रभावों का निर्धारण करने के लिए, विशेष रूप से बीजाणुओं, प्रारंभिक हाइफा और माइसेलियम पर अच्छी तरह से अनुकूल है।
यह विधि जैव नियंत्रण उत्पादों, विशेष रूप से पौधे से व्युत्पन्न उत्पादों की एंटीफंगल गतिविधि के लक्षण वर्णन के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है। दरअसल, संयंत्र के उपचार के लिए, परिणाम आवेदन के मोड की पसंद का मार्गदर्शन करने के लिए और ट्रिगर थ्रेसहोल्ड स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
फलों और सब्जियों का वैश्विक नुकसान उत्पादन के 50% तक पहुंच सकताहै1 और परिणामस्वरूप अधिकांशतर क्षेत्र में कवक खराब होने के कारण या फसल के बाद भंडारण2,3 के दौरान खाद्यक्षयहो सकता है, बीसवीं शताब्दी के मध्य से सिंथेटिक कवकनाशकों के व्यापक रोजगार के बावजूद । इन पदार्थों के उपयोग पर पुनर्विचार किया जा रहा है क्योंकि यह गंभीर पर्यावरणीय और स्वास्थ्य खतरों का प्रतिनिधित्व करता है । चूंकि उनके उपयोग के हानिकारक परिणाम पूरे पारिस्थितिकी तंत्र में दिखाई दे रहे हैं और संभावित स्वास्थ्य प्रभावोंके साक्ष्य5, 6जमा हो गए हैं, पुरानी रोगनिरोधी रणनीतियों के लिए उपन्यास विकल्प पूर्व और फसल के बाद के उपचार7,8,9के लिए विकसित किए जा रहे हैं। इसलिए हमारे सामने जो चुनौती है, वह दो गुना है । उपन्यास कवकनाशक रणनीतियों को सबसे पहले फाइटोपैथोजन के खिलाफ खाद्य संरक्षण की प्रभावकारिता के स्तर को बनाए रखना चाहिए और दूसरे, कृषि प्रथाओं के पर्यावरणीय पदचिह्न को नाटकीय रूप से कम करने में योगदान देना चाहिए । इस महत्वाकांक्षी लक्ष्य को पूरा करने के लिए, पौधों में विकसित प्राकृतिक सुरक्षा से प्रेरित रणनीतियों का प्रस्ताव किया जा रहा है क्योंकि 1000 से अधिक पौधों की प्रजातियों को उनके रोगाणुरोधी गुणों के लिए रेखांकित किया गया है8। उदाहरण के लिए, जिन पौधों ने फाइटोपैथोजन से लड़ने के लिए प्राकृतिक कवकनाशक विकसित किए हैं, वे नए जैव नियंत्रण उत्पादों के विकास की खोज में एक उपन्यास संसाधन हैं2। आवश्यक तेल इस प्रकार के प्रमुख अणु हैं। उदाहरण के लिए, ओरिगनम आवश्यक तेल ग्रीनहाउस 10 और सॉलिडागो कैनाडेन्सिस एल में ग्रे मोल्ड के खिलाफ टमाटर के पौधों की रक्षा करता है और कैसिया आवश्यक तेलों को ग्रे मोल्ड क्षति11,12से कटा हुआ स्ट्रॉबेरी को संरक्षित करने के लिए दिखाया गया है। ये उदाहरण स्पष्ट करते हैं कि बायोकंट्रोल और विशेष रूप से पौधे से व्युत्पन्न उत्पाद एक समाधान का प्रतिनिधित्व करते हैं जो जैविक प्रभावकारिता और पर्यावरणीय स्थिरता को जोड़ती है।
इस प्रकार, पौधे फसल संरक्षण उद्योग के लिए संभावित हित के अणुओं का एक महत्वपूर्ण संसाधन हैं । हालांकि केवल एक मुट्ठी भर पौधे उत्पादों को बायोकंट्रोल उत्पादों के रूप में उपयोग करने का प्रस्ताव किया गया है, भले ही उन्हें आम तौर पर सुरक्षित, गैर-फाइटॉक्सिक और पर्यावरण के अनुकूल 2 के रूप में पहचानाजाताहै। प्रयोगशाला से क्षेत्र में पक्षांतरण में कुछ कठिनाइयां देखी गई हैं, जैसे वीवो2,9में लागू होने के बाद प्रभावकारिता कम हो रही है। इस प्रकार, यह बेहतर क्षेत्र प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए प्रयोगशाला परीक्षणों की क्षमता में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है । इस संदर्भ में, पौधों से व्युत्पन्न उत्पादों के लिए एंटीफंगल परीक्षण विधियां उनकी एंटीफंगल प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने और उपयोग के लिए उनकी इष्टतम स्थितियों को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं। विशेष रूप से, बायोकंट्रोल उत्पाद आम तौर पर रासायनिक कवकनाशकों की तुलना में कम कुशल होते हैं, इसलिए उपयुक्त योगों का प्रस्ताव करने, क्षेत्रों में आवेदन के तरीके की पहचान करने और यह परिभाषित करने के लिए कि रोगजनक का विकासात्मक चरण उम्मीदवार बायोप्रोडक्ट के लिए असुरक्षित है, उनकी कार्रवाई के तरीके की बेहतर समझ महत्वपूर्ण है।
जीवाणुरोधी और एंटीफंगल गतिविधियों को संबोधित करने वाले वर्तमान दृष्टिकोणों में अगर-डिस्क प्रसार, कमजोर पड़ने, बायोऑटोग्राफी और प्रवाह साइटोमेट्री जैसे प्रसार विधियां शामिल हैं13. इन तकनीकों में से अधिकांश, और अधिक विशेष रूप से, मानक एंटीफंगल संवेदनशीलता परीक्षण – अगर-डिस्क प्रसार और कमजोर पड़ने परख – तरल निलंबन में बैक्टीरियल और फंगल बीजाणुओं पर घुलनशील यौगिकों की एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित हैं14. हालांकि, ये विधियां आम तौर पर सूखे पौधे के पाउडर जैसे ठोस यौगिकों का परीक्षण करने या माइसेलियम विकास के दौरान एंटीफंगल गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयुक्त नहीं होती हैं क्योंकि उन्हें आगर प्लेटों पर फैलने वाले बीजाणु कमजोर पड़ने या बीजाणु की आवश्यकता होती है और/या एंटीफंगल यौगिकों का कमजोर होना13. भोजन-जहर विधि में, एंटीफंगल एजेंट युक्त आगर प्लेटों को माइसेलियम शुरू करने की सटीक मात्रा पर विचार किए बिना 7 दिन पुरानी कवक संस्कृति से नमूना 5-7 मिमी व्यास डिस्क के साथ टीका लगाया जाता है। इनक्यूबेशन के बाद, एंटीफंगल गतिविधि रेडियल-ग्रोथ अवरोध के प्रतिशत के रूप में निर्धारित की जाती है17,18,19. इस दृष्टिकोण के साथ हम माइसेमल विकास पर एंटीफंगल गतिविधि का मूल्यांकन कर सकते हैं। इसके विपरीत, आगर-कमजोर पड़ने की विधि एंटीफंगल यौगिकों वाले आगर प्लेट की सतह पर सीधे टीका लगाने वाले बीजाणुओं पर एंटीफंगल गतिविधि निर्धारित करने के लिए की जाती है।13,20,21. ये दोनों दृष्टिकोण एंटीफंगल गतिविधि पर पूरक परिणाम देते हैं। हालांकि ये दो स्वतंत्र तकनीकें हैं जिनका उपयोग समानांतर में किया जाता है जो बीजाणुओं और माइसेलियम पर एंटीफंगल यौगिकों की सापेक्ष प्रभावकारिता की सटीक साथ-साथ तुलना प्रदान नहीं करते हैं17,20,22 चूंकि कवक सामग्री शुरू करने की मात्रा दो दृष्टिकोणों में भिन्न होती है। इसके अलावा, पौधे से प्राप्त उत्पाद की एंटीफंगल गतिविधि अक्सर रोगजनकों का सामना करने के लिए पौधों द्वारा संश्लेषित एंटीफंगल अणुओं के संयोजन से होती है। इन अणुओं में प्रोटीन, पेप्टाइड्स शामिल हैं23,24, और चयापचय में व्यापक रासायनिक विविधता होती है और पॉलीफेनॉल, टर्पेन, अल्कालोड्स जैसे अणुओं के विभिन्न वर्गों से संबंधित होते हैं।25, ग्लूकोसिनोलेट्स8, और ऑर्गेनोसल्फ़ यौगिक26. इनमें से कुछ अणु अस्थिर होते हैं या रोगजनक हमले के दौरान अस्थिर हो जाते हैं27. इन एजेंटों सबसे अधिक बार खराब पानी घुलनशील और उच्च वाष्प दबाव यौगिकों कि आवश्यक तेलों के रूप में पानी आसवन के माध्यम से बरामद किया जाना है, जिनकी रोगाणुरोधी गतिविधियों में से कुछ अच्छी तरह से स्थापित किया गया है28. वाष्प चरण मध्यस्थता संवेदनशीलता परख वाष्प चरण के माध्यम से वाष्पीकरण और प्रवास के बाद अस्थिर यौगिकों की रोगाणुरोधी गतिविधि को मापने के लिए विकसित किया गया है29. ये विधियां माइक्रोबियल संस्कृति से दूरी पर एंटीफंगल यौगिकों की शुरूआत पर आधारित हैं29,30,31,32,33. आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले वाष्प-चरण आगर परख में, आवश्यक तेलों को पेपर डिस्क पर जमा किया जाता है और बैक्टीरियल या फंगल बीजाणु निलंबन से दूरी पर पेट्री डिश के कवर के केंद्र में रखा जाता है, जो आगर माध्यम पर फैला हुआ है। विकास निषेध के क्षेत्र का व्यास तब उसी तरह मापा जाता है जैसे कि अगर-डिस्क प्रसार विधि के लिए20,24. अन्य दृष्टिकोणों को आवश्यक तेलों की वाष्प-चरण एंटीफंगल संवेदनशीलता का मात्रात्मक माप प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है, जो शोरबा-कमजोर पड़ने की विधि से प्राप्त होता है जिसमें से एक निरोधात्मक वाष्प-चरण मध्यस्थता एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि की गणना की गई थी32, या आगर-डिस्क प्रसार परख से व्युत्पन्न31. ये विधियां आम तौर पर वाष्प-चरण गतिविधि अध्ययनों के लिए विशिष्ट होती हैं और संपर्क-अवरोध परख के लिए उपयुक्त नहीं होती हैं। यह एक जटिल बायोएक्टिव मिश्रण की एंटीफंगल गतिविधि के लिए अस्थिर और गैर-अस्थिर एजेंटों के सापेक्ष योगदान के निर्धारण को रोकता है।
हमारे द्वारा विकसित की गई मात्रात्मक विधि का उद्देश्य बीजाणुओं की नियंत्रित मात्राओं पर सूखे पौधे के पाउडर के एंटीफंगल प्रभाव को मापना और एक आगर माध्यम की सतह पर जमा माइसेलियम कोपौधों के संक्रमण के दौरान फाइटोपैथोजन के हवाई विकास को पुन: उत्पन्न करने के साथ-साथ एक परस्पर माइसेलियल नेटवर्क16को पुन: मिलाना है । दृष्टिकोण एक संशोधित प्रयोगात्मक सेटअप है जो आगर-कमजोर पड़ने और खाद्य-जहर विधियों के आधार पर है जो एक ही प्रयोगात्मक सेटअप में, अस्थिर और गैर-अस्थिर एंटीफंगल मेटाबोलाइट्स दोनों के योगदान का साथ-साथ मात्राकरण की अनुमति देता है। इस अध्ययन में, विधि को तीन अच्छी तरह से विशेषता वाले एंटीफंगल तैयारी की गतिविधि के खिलाफ बेंचमार्क किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण न्यूनतम प्रसंस्कृत संयंत्र-व्युत्पन्न उत्पादों के एंटीफंगल गुणों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, आगर की सतह पर बीजाणुओं का समरूप वितरण 2 मिमी ग्लास मोति…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी बहुमूल्य सलाह के लिए फ्रैंक येट्स के बहुत आभारी हैं । इस काम को सुप बायोटेक ने समर्थन दिया था।
Materials
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 – 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 – 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 – 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
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