Mätning av biokontrollprodukters flyktiga och icke-flyktiga svampdödande aktivitet

Summary

Vi beskriver en modifierad agarbaserad metod utformad för att kvantifiera de svampdödande effekterna av växtbaserade produkter. Både flyktiga och icke-flyktiga bidrag till den svampdödande verksamheten kan bedömas genom detta protokoll. Dessutom kan effekt mot svampar mätas i viktiga utvecklingsstadier i en enda experimentell installation.

Abstract

Det beskrivna protokollet bygger på en plug-transfer-teknik som möjliggör noggrann bestämning av mikroorganismkvantiteter och deras utvecklingsstadier. Ett angivet antal sporer sprids på en agarplatta. Denna agarplatta inkuberas under en definierad period för att svamparna ska kunna nå det förväntade utvecklingsstadiet, med undantag för sporer där inkubation inte krävs. Agarpluggar täckta av sporer, hyphae eller mycelium dras sedan tillbaka och överförs till agarmedier som innehåller den svampdödande förening som ska testas antingen placerad på avstånd från svamparna eller i kontakt. Denna metod är tillämplig för att testa både flytande extrakt och fasta prover (pulver). Det är särskilt väl lämpat för kvantifiering av de relativa bidragen från flyktiga och icke-flyktiga medel i bioaktiva blandningar och för att bestämma deras effekter, särskilt på sporer, tidig hyphae och mycelium.

Metoden är mycket relevant för karakteriseringen av biokontrollprodukters svampdödande aktivitet, särskilt växtbaserade produkter. När det gäller växtrening kan resultaten användas för att vägleda valet av användningssätt och för att fastställa tröskelvärdena för utlösande ämnen.

Introduction

Globala förluster av frukt och grönsaker kan nå upp till 50% av produktionen^{1 och} resultera främst från matförfall orsakad av svampförstöring i fält eller under lagring^{efter skörden 2,3}, trots den omfattande sysselsättningen av syntetiska fungicider sedan mitten av 1900-talet⁴. Användningen av dessa ämnen omprövas eftersom den utgör allvarliga miljö- och hälsorisker. Eftersom de skadliga konsekvenserna av deras användning dyker upp i hela ekosystemen och bevis på potentiella hälsoeffekter har ackumulerats^5,6, utvecklas nya alternativ till gamla profylaktiska strategier för behandlingar före och efter^{skörden 7,8,9}. Därför är utmaningen vi står inför dubbel. Nya fungicidstrategier måste för det första bibehålla effektiviteten hos livsmedelsskyddet mot fytopatogener och samtidigt, för det andra, bidra till att dramatiskt minska jordbruksmetoders miljöavtryck. För att uppfylla detta ambitiösa mål föreslås strategier inspirerade av det naturliga försvaret som utvecklats i växter eftersom mer än 1000 växtarter har lyfts fram för sina antimikrobiella egenskaper⁸. Till exempel är växter som har utvecklat naturliga fungicider för att bekämpa fytopatogener en ny resurs för att utforska utvecklingen av nya biokontrollprodukter². Eteriska oljor är flaggskeppsmolekyler av denna typ. Till exempel skyddar Origanum eterisk olja tomatplantor mot gråmögel i växthus ¹⁰ och Solidago canadensis L. och fatias eteriska oljor har visat sig bevara efterskördade jordgubbar från grå mögelskador^11,12. Dessa exempel visar att biokontroll och särskilt växtbaserade produkter utgör en lösning som kombinerar biologisk effektivitet och miljömässig hållbarhet.

Växter är således en viktig resurs för molekyler av potentiellt intresse för växtskyddsindustrin. Endast en handfull vegetabiliska produkter har dock föreslagits användas som biokontrollprodukter trots att de allmänt erkänns som säkra, icke-fytotoxiska och miljövänliga². Vissa svårigheter i införlivandet från labbet till fältet har observerats, såsom effekt minska när tillämpas in vivo^2,9. Således blir det viktigt att förbättra laboratorietesternas förmåga att bättre förutsäga fälteffektiviteten. I detta sammanhang är svampdödande testmetoder för växtbaserade produkter nödvändiga både för att utvärdera deras svampdödande effekt och för att definiera deras optimala användningsvillkor. Specifikt är biokontrollprodukter i allmänhet mindre effektiva än kemiska fungicider, så en bättre förståelse av deras verkningssätt är viktigt för att föreslå lämpliga formuleringar, för att identifiera användningssättet inom fält och för att definiera vilket utvecklingsstadium av patogenen som är sårbart för den sökande bioprodukten.

Nuvarande metoder för antibakteriella och svampdödande aktiviteter inkluderar diffusionsmetoder som agar-diskdiffusion, utspädning, bioautografi och flödescytometri¹³. De flesta av dessa tekniker, och mer specifikt standardtestning av antifungal känslighet – agar-disk diffusion och utspädningsanalyser – är väl anpassade för att utvärdera den antimikrobiella aktiviteten hos lösliga föreningar på bakteriella och svampsporer i flytande suspensioner¹⁴. Dessa metoder är dock i allmänhet inte lämpliga för att testa fasta föreningar såsom torkat växtpulver eller för att kvantifiera svampdödande aktivitet under myceliumtillväxt eftersom de kräver sporutspädning eller sporspridning på agarplattor och/eller utspädning av svampdödande föreningar.¹³. I den livsmedelsförgiftade metoden vaccineras agarplattor som innehåller det svampdödande medlet med en 5-7 mm diameter skiva som provtas från en 7-dagars gammal svampkultur utan att ta hänsyn till den exakta mängden start av mycelium. Efter inkubation bestäms den svampdödande aktiviteten som en procent av radiell tillväxthämning^17,18,19. Med detta tillvägagångssätt kan vi utvärdera den svampdödande aktiviteten på mycelial tillväxt. Däremot utförs agar-utspädningsmetoden för att bestämma den svampdödande aktiviteten på sporer som direkt inokuleras på ytan av agarplattan som innehåller svampdödande föreningar^13,20,21. Dessa två metoder ger kompletterande resultat när det gäller svampdödande verksamhet. Dessa är dock två oberoende tekniker som används parallellt och som inte ger korrekt jämförelse sida vid sida av den relativa effekten av svampdödande föreningar på sporer och mycelium^17,20,22 eftersom mängden startsvampmaterial skiljer sig åt i de två metoderna. Dessutom är den svampdödande aktiviteten hos en växtbaserad produkt ofta resultatet av kombinationen av svampdödande molekyler syntetiserade av växter för att möta patogener. Dessa molekyler omfattar proteiner, peptider^23,24, och metaboliter med bred kemisk mångfald och som tillhör olika klasser av molekyler såsom polyfenoler, terpener, alcaloïds²⁵, glukosinolater⁸, och organosulfurföreningar²⁶. Vissa av dessa molekyler är flyktiga eller blir flyktiga under patogenattack²⁷. Dessa medel är oftast dåligt vattenlösliga och högtrycksföreningar som måste återvinnas genom vattendestillation som eteriska oljor, av vilka några av vars antimikrobiella verksamhet har varit väl etablerad²⁸. Ångfasmedierade känslighetsanalyser har utvecklats för att mäta den antimikrobiella aktiviteten hos flyktiga föreningar efter avdunstning och migration via ångfasen²⁹. Dessa metoder är baserade på införandet av svampdödande föreningar på avstånd från den mikrobiella kulturen^{29,30,31,32,33}. I den vanliga ångfasen agaranalys deponeras eteriska oljor på en pappersskiva och placeras i mitten av petriskålens lock på avstånd från bakteriell eller svampsporsuspension, som sprids på agarmedium. Diametern på tillväxthämningszonen mäts sedan på samma sätt som för agar-diskdiffusionsmetoden^20,24. Andra metoder har utvecklats för att ge kvantitativ mätning av ångfasens antifunktionella känslighet för eteriska oljor, härledda från den buljongutspädningsmetod från vilken en hämmande ångfasmedierad antimikrobiell aktivitet beräknades³², eller härrör från agar-disk diffusionsanalyser³¹. Dessa metoder är i allmänhet specifika för aktivitetsstudier i ångfas och är inte lämpliga för kontakthämningsanalyser. Detta utesluter bestämning av det relativa bidraget från flyktiga och icke-flyktiga agenser till den svampdödande aktiviteten hos en komplex bioaktiv blandning.

Den kvantitativa metoden vi har utvecklat syftar till att mäta den svampdödande effekten av torkat växtpulver på kontrollerade mängder sporer och odlat mycelium deponerat på ytan av ett agarmedium för att reproducera flygtillväxten av fytopatogener under infektion av^{växter 15} samt ett sammankopplat mycelialnät¹⁶. Tillvägagångssättet är en modifierad experimentell inställning baserad på agar-utspädning och livsmedelsförgiftade metoder som också möjliggör, i samma experimentella installation, sida vid sida kvantifiering av bidraget från både flyktiga och icke-flyktiga antifungala metaboliter. I denna studie har metoden benchmarkats mot aktiviteten hos tre väl karakteriserade svampdödande preparat.

Protocol

1. Inokula beredning Före experimentet, lägg 5 μL Trichoderma spp. SBT10-2018 sporer lagrade vid 4 °C på potatisdextrosa agar medium (PDA) och inkubera i 4 dagar vid 30 °C med regelbunden ljusexponering för att främja konidiabildning42 (figur 1, panel A).OBS: Trichoderma spp. SBT10-2018 har isolerats från trä och används som modell i denna studie för sin snabba tillväxt och enkla sporåtervinning. Denna stam bevaras av vår…

Representative Results

För att utvärdera den kvantitativa metodens förmåga att diskriminera verkningssättet hos olika typer av svampdödande föreningar jämförde vi effekten av tre välkända svampdödande medel. Kardendazim är en icke-flyktig syntetisk fungicid som har använts i stor utsträckning för att kontrollera ett brett spektrum av svampsjukdomar iväxter 39,40. Thymus vulgaris eteriska olja har till stor del beskrivits för sin antibakteriella och svampdöda…

Discussion

Det tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör utvärdering av svampdödande egenskaper hos minimalt bearbetade växtbaserade produkter. I detta protokoll uppnås homogen fördelning av sporer på agarytan med hjälp av 2 mm glaspärlor. Detta steg kräver hanteringsförmåga för att korrekt fördela pärlorna och få reproducerbara resultat, vilket i slutändan gör det möjligt att jämföra svampdödande effekter i olika stadier av svamptillväxt. Vi fann att 5 mm glaspärlor eller överdriven rotation und…

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/