유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

Summary

이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.

Abstract

신체에서 직접 재생을 유도하는 재생을 유도하는 재생 가능한 생체 재료의 사용은 번역 관점에서 매력적인 전략입니다. 이러한 물질은 이식 시 염증 반응을 유도하며, 이는 물질의 후속 흡수와 새로운 조직의 재생의 원동력이다. 이 전략, 또한 시투 조직 공학에서 로 알려진, 조직 설계 혈관 이식 등 심장 혈관 교체를 얻기 위해 추구. 염증 및 재생 공정 은 스캐폴드 (즉, 스트레치 및 전단 응력)에 대한 국소 생체 역학 적 단서에 의해 결정됩니다. 여기서는 관 비계에서 스트레치및 전단 응력을 분리할 수 있는 맞춤형 생물 반응기의 사용을 자세히 설명합니다. 이를 통해 인간 대식세포와 근섬유아세포아제를 이용한 역동적인 공동배양 실험에 기초하여 입증되는 잘 조절된 기계적 하중의 영향으로 관 비계의 염증및 재생 능력의 체계적이고 표준화된 평가를 가능하게 한다. 바이오 반응기의 구성 및 설정, 비계 및 세포 파종의 준비, 스트레치 및 전단 흐름의 적용 및 유지 보수, 분석을 위한 샘플 수확 등 이 접근법의 주요 실용적인 단계는 자세히 설명합니다.

Introduction

심혈관 조직 공학(TE)은 현재 사용되는 영구 심혈관 보철물(예를 들어, 혈관 이식, 심장 판막 교체)에 대한 대체 치료 옵션으로 추구되고 있으며, 이는 환자의 큰 코호트에 대해 최적이 아니다^1,2,3,4. 많은 수요가 응용 프로그램은 조직 엔지니어링 혈관 이식편 (TEVGs)^5,6 및 심장 판막 (TEHV)^7,8을포함한다. 대부분의 경우, 심장 혈관 TE 방법론은 새로운 조직이 형성될 수 있는 유익한 발판역할을 하는 개역 가능한 생체 재료(천연 또는 합성)를 사용합니다. 새로운 조직의 형성은 체외에서 완전히 설계될 수 있으며, 세포와 함께 스캐폴드를 시드하고 이식 전에 생체 반응기에서 배양하여^(체외TE)^9,10,11,또는 직접 앉아서 합성 스캐폴드가 체내에서 직접 새로운 조직의 형성을 유도하기 위해 사전 배양없이 이식된다( 12) 1,^12. 시험관 내 및 시투 심혈관 TE 접근법의 경우 성공적인 기능성 재생은 이식된 구조에 대한 숙주 면역 반응과 적절한 생체 기계적 적재모두에 크게 의존합니다.

심혈관 TE용 생체역학적 하중의 중요성은^15. 심혈관 임플란트의 경우, 스캐폴드를 채우는 세포는 혈역학적 환경의 결과로 발생하는 순환 스트레칭및 전단 응력에 노출됩니다. 수많은 연구는 콜라겐^16,17,18,19,글리코소미노글리산 (GAGs)^20,및 엘라스틴^(21,22)및 다양한 세포 유형에 의해 매트릭스 성분의 형성에 (순환) 스트레칭의 자극 효과를보고했다. 예를 들어, 황 외는 혈관^{생물반응기(23)를}이용하여 체외 TEVG에서 콜라겐 및 엘라스틴의 증착 및 조직을 상승시키는 양축 스트레칭을 입증했다. 강조는 일반적으로 지배적 인 부하로 스트레칭에 놓여 있지만, 이러한 연구는 종종 샘플이 전단 흐름에 노출되는 흐름 중심의 생물 반응기를 사용합니다. 3D의 조직 형성과 염증에 대한 전단 응력의 고립 된 영향에 대해서는 상대적으로 거의 알려져 없지만 일부 데이터를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Hinderer 외. 및 Eoh 외. 전단 흐름, 3D 스캐폴드 미세 구조 이외에, 체외 모델^{시스템(24,25)에서}인체 혈관 평활근 세포에 의한 성숙한 엘라스틴형성에 중요했다. 전부, 이 사실 인정은 심장 혈관 TE를 위한 순환 스트레칭 및 전단 긴장 둘 다의 관련성을 보여줍니다.

TE 임플란트의 성공 또는 실패에 대한 또 다른 중요한 결정요인은 이식된^{접목(26)에}대한 호스트의 면역 반응이다. 이는 실제로 세포 유입 및 내인성 조직 형성 및 리모델링^27의후속 과정을 킥스타트하기 위해 스캐폴드에 대한 급성 염증 반응에 의존하는 시투 TE 전략에서 물질 중심의 물질 중심의 물질 중심을 위해 특히 중요하다. 대식세포는 기능성 조직 재생의 중요한 시노레이터이며, 이는 다중 연구^28,29,30에의해 나타났다. 상처 치유와 유사하게, 조직의 재생은 섬유아세포와 근섬유세포 와 같은 대식세포와 조직 생성 세포 사이의 파라크리노 신호에 의해 지배된다^31,32,33. 새로운 조직 증착을 조정하는 것 외에도, 대식세포는^{이물질(34,35)의}활성 재흡수에 관여한다. 이와 같이, 생체물질에 대한 체외 대식세포반응은^{임플란트(36,37,38)의}생체 내 성공을 위한 예측 파라미터로서 확인되었다.

이식된 스캐폴드에 대한 대식대식 반응은 재료 조성 및^{미세구조(35,39,40)와}같은 스캐폴드 설계 기능에 의존한다. 스캐폴드 특성 외에도 비계에 대한 대식대식 반응과 근섬유아세포와의 교차토크도 혈역학적 하중의 영향을 받았습니다. 예를 들어, 순환 스트레치는 대식세포 표현형^41,42,43,44 및 사이토카인의 분비(43,^44,45,46in 3D 일렉트로스펀 스캐폴드)의 중요한 변조기로 나타났다. 대식세포와 혈관 평활근 세포의 공동 배양 시스템을 사용하여, Battiston 등. 대식세포의 존재는 엘라스틴과 GAGs의 증가 수준으로 이어졌고 순환 스트레치 (1.07-1.10)의 적당한 수준이 콜라겐 I와 엘라스틴^47의증착을 자극했다는 것을 입증했습니다. 전작에서는 전단 응력이 3D 전두엽 비계^48,49로단백세포 모집을 위한 중요한 결정제이며, 전단 응력과 순환 스트레치 모두 인간 단세포와 중간엽 기질^세포(50)사이의 파라크리온 신호에 영향을 미친다는 것을 입증하였다. Fahy 등은 전단 흐름이 인간^{단핵구(51)에}의한 염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 것을 입증했다.

종합하면, 위의 증거는 혈역학 적재에 대한 적절한 이해와 제어가 심혈관 TE에 매우 중요하며 이를 달성하기 위해 염증 반응을 고려하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다. 수많은 생물 반응기는 이전에 시험관 내^{52,53,54,55, 56,57,57,58} 또는 전 생체^59,60,61 심혈관 조직의 문화를 위해 이전에 기술되었다. 그러나 이러한 모든 시스템은 가능한 한 생리적 혈역학 적재 조건을 모방하도록 설계되었습니다. 이것은 시험관 내에서 심장 혈관 조직을 만들거나 전 생체 문화를 유지하기위한 목적으로 매우 가치가 있지만, 이러한 시스템은 개별 단서의 개별 효과에 체계적인 연구를 허용하지 않습니다. 이는 이러한 생물 반응기에서 순환 스트레칭과 전단 응력의 적용이 본질적으로 연결되는 동일한 가압 흐름에 의해 구동되므로. 정확한 멀티큐 기계식 조작을 허용하는 마이크로시스템은 2D 기판⁶² 또는 3D 하이드로겔 설정^63,64에대해 설명되어 왔지만, 이러한 설정은 탄성액 3D 생물재료 스캐폴드의 통합을 허용하지 않는다.

여기에서, 우리는 유일하게 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게하고 기계적으로 그들의 개별및 결합된 효력을 조사하는 것을 돕는 관 생물 반응기 시스템의 응용을 제시합니다. 이 시스템은 조직 설계 혈관 이식의 광범위한 테스트를 허용 (예를 들어, 합성 또는 자연 기원, 다른 마이크로 아키텍처, 다양한 다공성). 전단 응력과 스트레치의 적용을 효과적으로 분리하기 위해, 생체 반응기에서 사용하는 주요 개념은 (1) 뚜렷한 펌프 시스템을 사용하여 전단 응력 및 스트레치 제어의 분리와 (2) 스캐폴드의 자극을 계산 구동 치수로 ‘내부 아웃’방식으로 분리하는 것이다. 흐름은 유동 펌프의 사용을 통해 관 비계의 외부 표면에 적용되는 반면, 스캐폴드의 일주 스트레칭은 별도의 스트레인 펌프를 사용하여 스캐폴드가 장착되는 실리콘 튜브를 확장하여 유도된다. 구성을 포함하는 실리콘 튜브및 유리 튜브의 치수는 스캐폴드(흐름에 의한) 및 외주 스트레치(튜브 팽창로 인한)의 전단 응력이 서로 크게 영향을 미치지 않도록 하기 위해 전산 유체 역학 시뮬레이션을 사용하여 신중하게 선택및 검증된다. 이 내부 아웃 디자인은 몇 가지 실용적인 근거가 있습니다. 발광 유체 압력(생리적 적재와 유사)에 의해 스트레치가 적용되는 경우, 본질적으로 샘플 설계가 누출되지 않습니다. 또한, 시료를 스트레칭하는 데 필요한 압력은 시료 강성에 의해 완전히 결정되며, 이는 시간이 지남에 따라 샘플과 샘플 내에서 다를 수 있어 스트레치를 제어하기가 어려워집니다. 이 생물 반응기는 실리콘 튜브 주위에 조직 설계 이식편을 장착하고 접목의 외벽에 벽 전단 응력 (WSS) 응용 프로그램을 허용하고 내부에서 접목을 가압합니다. 이러한 방식으로, 시간이 지남에 따라 샘플과 샘플 내의 동일한 하중 조건을 보장할 수 있으며, 또한, 다공성 혈관^{비계(19)에}공통적으로 도공되는 바와 같이 시료가 새는 것을 허용한다. 이 내부 아웃 생물 반응기는 특히 전통적인 혈관 생물 반응기 설치가 더 적합한 시험관 내의 토착 혈관의 엔지니어링보다는 전단 및 / 또는 스트레치의 효과에 대한 체계적인 연구를 위한 것입니다. 생물 반응기 설계 도면에대한 그림 1A-B를 참조하고, 생체 반응기의 주요 구성 요소 뒤에 기능적 설명 및 근거에 대한 해당 표 1을 참조하십시오.

생물 반응기의 사용은 우리가 시상 심혈 관 조직^19,43,44에대한 반사 전기 스프폴드에서 염증과 조직 형성에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개인 및 결합 된 영향을 조사하는 우리 그룹에 의해 최근 연구의 시리즈에 기초하여 입증된다. 이를 위해, 우리는 인간 대식세포와 근섬유아세포를 모노 또는 공동 배양에서 사용하여 시투 재생 폭포의 다양한 단계를 시뮬레이션했습니다. 우리는 인간 대식세포에 의한 사이토카인 분비액이 이러한 비계에서 인간 근섬유세포에 의해 매트릭스 증착 및 조직에 영향을 미치는 순환 스트레치 및 전단 응력 모두에 의해 뚜렷하게 영향을 받는것을 입증했으며, 파라크리노 신호 및 직접 접촉^19,43,44를통해. 특히, 이러한 연구는 전단 스트레스와 스트레칭의 결합 된 응용 프로그램의 경우, 조직 형성과 염증에 미치는 영향은 두 부하 중 하나에 의해 지배된다는 것을 밝혔다, 또는 두 부하의 시너지 효과가있다. 이러한 연구 결과는 TE 공정에서 기계적 환경의 기여를 더 잘 이해하기 위해 두 부하를 분리하는 관련성을 보여줍니다. 이러한 이해는 관련 혈역학 적재 기조에서 스캐폴드 설계 파라미터를 체계적으로 최적화하기 위해 적용될 수 있습니다. 또한, 이러한 잘 조절된 환경에서 의 기계형 데이터는 최근 TEVGs⁶⁵ 또는 TEHV^66에대해 보고된 바와 같이, 시투 조직 리모델링 과정을 예측하기 위해 개발되고 있는 수치 모델에 대한 입력으로 작용할 수 있으며, 예측 능력을 더욱 향상시킨다.

Protocol

이 프로토콜에 설명된 연구에서, 관상 동맥 바이패스 수술 후 사페누스 정맥으로부터 분리된 말초 혈액 버피 코트와 인간 근섬유아세포로부터 분리된 1차 인간 대식세포가44개사용되었다. 버피 코트는 산퀸 연구 기관 의료 윤리위원회의 승인을 받은 서면 동의를 제공한 건강하고 익명화된 자원봉사자들로부터 얻어졌습니다. 인간의 베나 사페나 세포의 사용 (HVSC) 네덜란드에서 ?…

Representative Results

이 생물 반응기는 혈관 조직 성장에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개별적이고 결합 된 효과를 연구하고 3D 생체 물질 스캐폴드에서 리모델링하기 위해 개발되었다. 생물 반응기의 설계는 다양한 적재 조건하에서 최대 8개의 혈관 구조를 배양할 수 있게한다(도 1A). 혈관 구조는 둘레 스트레치와 WSS가 독립적으로 제어될 수 있는 유량 배양챔버(도 1B)에</stron…

Discussion

본 명세서에 기재된 생물반응기는 관내 반사성 스캐폴드에서 염증 및 조직 재생에 대한 전단 스트레스 및 순환 스트레칭의 개별 및 결합된 효과의 기여도를 체계적으로 평가할 수 있다. 또한 이 방법을 사용하면 대표적인 결과 섹션에서 예시된 바와 같이 혈관 구조에서 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이러한 결과는 TEVG 구조의 성장과 리모델링 모두에 다양한 혈역학 적재 체제(즉, 전단및 스?…

Materials

advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor – "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens – Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 – lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding