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Engineering

Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

Published: December 10, 2020
doi:
10.3791/61824
, , , , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS),Eindhoven University of Technology

Summary

O objetivo deste protocolo é executar uma co-cultura dinâmica de macrófagos humanos e miofibroblasts em andaimes eletroscarados tubulares para investigar a regeneração de tecidos conduzidos por materiais, usando um bioreator que permite o desacoplamento do estresse da tesoura e do estiramento cíclico.

Abstract

O uso de biomateriais resorbáveis para induzir a regeneração diretamente no corpo é uma estratégia atraente do ponto de vista translacional. Tais materiais induzem uma resposta inflamatória após a implantação, que é o condutor da posterior resorção do material e da regeneração de novos tecidos. Essa estratégia, também conhecida como engenharia de tecidos in situ, é perseguida para obter substituições cardiovasculares, como enxertos vasculares projetados por tecidos. Tanto os processos inflamatórios quanto os regenerativos são determinados pelas pistas biomecânicas locais no andaime (ou seja, estresse de estiramento e calha). Aqui, descrevemos em detalhes o uso de um bioreator desenvolvido sob medida que permite exclusivamente a dissociação do estresse de estiramento e tesoura em um andaime tubular. Isso permite a avaliação sistemática e padronizada da capacidade inflamatória e regenerativa dos andaimes tubulares sob a influência de cargas mecânicas bem controladas, que demonstramos com base em um experimento dinâmico de co-cultura usando macrófagos humanos e miofibroblasts. As principais etapas práticas dessa abordagem — a construção e a configuração do bioreator, a preparação dos andaimes e a semeadura de células, a aplicação e a manutenção do fluxo de estiramento e cisalhamento e a colheita de amostras para análise — são discutidas detalhadamente.

Introduction

A engenharia de tecidos cardiovasculares (TE) está sendo perseguida como opção alternativa de tratamento às próteses cardiovasculares permanentes atualmente utilizadas (por exemplo, enxertos vasculares, substituições de válvulas cardíacas), que são subótimas para grandes coortes de pacientes1,2,3,4. Aplicações muito procuradas incluem enxertos vasculares (TEVGs)5,6 e válvulas cardíacas (TEHVs)7,8. Na maioria das vezes, as metodologias cardiovasculares de TE fazem uso de biomateriais resorbáveis (naturais ou sintéticos) que servem como um andaime instrutivo para a formação do novo tecido. A formação de novos tecidos pode ser projetada completamente in vitro, semeando o andaime com células e culminando em um bioreator antes da implantação (te in vitro)9,10,11, ou diretamente in situ, em que o andaime sintético é implantado sem pré-cultivo, a fim de induzir a formação de novos tecidos diretamente no corpo (in situ TE)12,13,14. Tanto para abordagens in vitro quanto in situ cardiovascular TE, a regeneração funcional bem sucedida é predominantemente dependente tanto da resposta imune do hospedeiro à construção implantada quanto do carregamento biomecânico adequado.

A importância do carregamento biomecânico para te cardiovascular é bem reconhecida15. No caso dos implantes cardiovasculares, as células que povoam o andaime são expostas ao estiramento cíclico e estresses de cisalhamento que surgem como resultado do ambiente hemodinâmico. Inúmeros estudos têm relatado o efeito estimulante do estiramento (cíclico) na formação de componentes matriciais, como o colágeno16,17,18,19, glicosaminoglicas (GAGs)20e elastina21,22, por vários tipos de células. Por exemplo, Huang et al. demonstraram que o estiramento biaxial elevou a deposição e organização do colágeno e da elastina em TEVGs in vitro usando um bioreator vascular23. Embora a ênfase tipicamente reside no alongamento como a carga dominante, esses estudos muitas vezes fazem uso de bioreatores orientados pelo fluxo em que a amostra também é exposta ao fluxo de cisalhamento. Embora relativamente pouco se saiba sobre a influência isolada das tensões de tesoura na formação de tecidos e inflamação em 3D, alguns dados estão disponíveis. Por exemplo, Hinderer et al. e Eoh et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento, além de uma microestrutura de andaime 3D, foi importante para a formação de elastina madura por células musculares vasculares humanas em um sistema de modelo in vitro24,25. Ao todo, esses achados ilustram a relevância tanto do alongamento cíclico quanto do estresse de cisalhamento para te cardiovascular.

Outro determinante importante para o sucesso ou falha dos implantes de TE é a resposta imune do hospedeiro ao enxerto implantado26. Isso é particularmente importante para estratégias de TE in situ in situ, que realmente contam com a resposta inflamatória aguda ao andaime para iniciar os processos subsequentes de influxo celular e formação de tecido endógeno e remodelação27. O macrófago é um iniciador crítico da regeneração do tecido funcional, que tem sido mostrado por múltiplos estudos28,29,30. Análoga à cicatrização de feridas, a regeneração do tecido é regida pela sinalização paracrina entre macrófagos e células produtoras de tecidos, como fibroblastos e miofibroblasts31,32,33. Além de coordenar a nova deposição tecidual, os macrófagos estão envolvidos na resorção ativa do material do andaime estrangeiro34,35. Como tal, a resposta in vitro de macrófago a um bioma material foi identificada como parâmetro preditivo para o sucesso in vivo dos implantes36,37,38.

A resposta do macrófago a um andaime implantado depende de características de design de andaimes, como composição de material e microestrutura35,39,40. Além das propriedades do andaime, a resposta do macrófago a um andaime e seu crosstalk com myofibroblasts também é impactada por cargas hemodinâmicas. Por exemplo, o estiramento cíclico mostrou-se um importante modulador do fenótipo macrófago41,42,43,44 e a secreção de citocinas43,44,45,46 em andaimes eletroscardos 3D. Utilizando um sistema de co-cultura de macrófagos e células musculares lisas vasculares, Battiston et al. demonstraram que a presença de macrófagos levou ao aumento dos níveis de elastina e GAGs e que níveis moderados de estiramento cíclico (1,07-1,10) estimularam a deposição do colágeno I e elastina47. Em trabalhos anteriores, demonstramos que o estresse da cisalhamento é um importante determinante para o recrutamento de monócitos em andaimes eletroscados3D 48,49, e que tanto o estresse da cisalhamento quanto o estiramento cíclico impactam a sinalização paracrina entre monócitos humanos e células estrômicas mesenquimais50. Fahy et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias por monócitos humanos51.

Em conjunto, as evidências acima mostram que uma compreensão adequada e controle sobre cargas hemodinâmicas é crucial para o TE cardiovascular, e que é importante considerar a resposta inflamatória para conseguir isso. Inúmeros bioreatores foram descritos anteriormente para a cultura in vitro52,53,54,55,56,57,58 ou ex vivo59,60,61 cultura de tecidos cardiovasculares. No entanto, todos esses sistemas são projetados para imitar as condições fisiológicas de carregamento hemodinâmico tanto quanto possível. Embora isso seja altamente valioso para o propósito de criar tecidos cardiovasculares in vitro ou manter culturas ex vivo, tais sistemas não permitem estudos sistemáticos sobre os efeitos individuais das pistas individuais. Isso ocorre porque a aplicação tanto do estresse cíclico quanto do cisalhamento nesses bioreatores é impulsionada pelo mesmo fluxo pressurizado, que os liga intrinsecamente. Embora microsistemas que permitam manipulação mecânica precisa de várias pistas tenham sido descritos para substratos2D configurações de hidrogel 62 ou 3D63,64, tais configurações não permitem a incorporação de andaimes biomateriais 3D elastoméricos.

Aqui, apresentamos a aplicação de um sistema bioreator tubular que permite exclusivamente o desacoplamento do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico e ajuda a investigar mecanicamente seus efeitos individuais e combinados. Este sistema permite testar uma ampla variedade de enxertos vasculares projetados por tecido (por exemplo, origem sintética ou natural, microarquiteção diferente, várias porosidades). Para efetivamente desacoplar a aplicação do estresse e do alongamento da tesoura, os conceitos-chave que o bioreator usa são (1) separação do controle do estresse e do estiramento da tesoura usando sistemas de bomba distintos e (2) estimulação dos andaimes de forma “de dentro para fora” com dimensões computacionalmente orientadas. O fluxo é aplicado na superfície externa do andaime tubular através do uso de uma bomba de fluxo, enquanto o trecho circunferencial do andaime é induzido pela expansão de um tubo de silicone no qual o andaime é montado através do uso de uma bomba de tensão separada. As dimensões do tubo de silicone e do tubo de vidro que contém a construção são cuidadosamente escolhidas e validadas por meio de simulações de dinâmica computacional de fluidos, para garantir que o estresse da cisalhamento no andaime (devido ao fluxo) e o estiramento circunferencial (devido à expansão do tubo) não afetem significativamente uns aos outros. Este design de dentro para fora tem várias lógicas práticas. Se o estiramento for aplicado pela pressão do fluido luminal (semelhante ao carregamento fisiológico), ele requer inerentemente que o desenho da amostra seja livre de vazamentos. Além disso, a pressão necessária para esticar a amostra seria completamente determinada pela rigidez amostral, que pode variar entre amostras e dentro de uma amostra ao longo do tempo, dificultando o controle do trecho. Este bioreator monta o enxerto de tecido projetado em torno de um tubo de silicone e permite a aplicação de estresse de corte de parede (WSS) na parede externa do enxerto e pressuriza o enxerto por dentro. Dessa forma, condições iguais de carregamento entre amostras e dentro das amostras ao longo do tempo podem ser garantidas, e, além disso, as amostras podem ser vazadas, como é comum para andaimes vasculares porosos19. Este bioreator de dentro para fora destina-se especificamente a estudos sistemáticos sobre os efeitos da tesoura e/ou alongamento, em vez da engenharia de um vaso sanguíneo nativo in vitro, para o qual as configurações tradicionais de bioreatores vasculares são mais adequadas. Consulte a Figura 1A-B para os desenhos de design bioreator, e sua tabela correspondente 1 para uma descrição funcional e racionalidade por trás dos principais componentes do bioreator.

O uso do bioreator é demonstrado com base em uma série de estudos recentes do nosso grupo em que investigamos as influências individuais e combinadas do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e formação tecidual em andaimes eletrosopunis resorbáveis para in situ tecido cardiovascular19,43,44. Para isso, usamos macrófagos humanos e miofibroblasts em mono ou em co-cultura para simular as várias fases da cascata regenerativa in situ. Demonstramos que a secreção de citocinas por macrófagos humanos é claramente impactada tanto pelo estresse do estiramento cíclico quanto pelo cisalhamento, afetando a deposição matricial e a organização por myofibroblasts humanos nestes andaimes, tanto via sinalização paracririna quanto pelo contato direto19,43,44. Notavelmente, esses estudos revelaram que, no caso da aplicação combinada de estresse e alongamento da tesoura, os efeitos na formação e inflamação tecidual são dominados por uma das duas cargas, ou há efeitos sinérgicos de ambas as cargas. Esses achados ilustram a relevância da desacoplamento de ambas as cargas para obter uma melhor compreensão da contribuição do ambiente mecânico nos processos de TE. Esse entendimento pode ser aplicado para otimizar sistematicamente parâmetros de design de andaimes em regimes de carregamento hemodinâmicos relevantes. Além disso, os dados mecanicistas de ambientes tão bem controlados podem servir de entrada para modelos numéricos que estão sendo desenvolvidos para prever o curso da remodelação de tecidos in situ, como relatado recentemente para TEVGs65 ou TEHVs66, para melhorar ainda mais a capacidade preditiva.

Protocol

Nos estudos descritos neste protocolo, macrófagos humanos primários isolados de casacos periféricos de sangue e miofibroblasts humanos isolados da veia safena após cirurgia coronariana por passagem foram utilizados44. Os casacos buffy foram obtidos de voluntários saudáveis e anonimizados que forneceram consentimento por escrito informado, que foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica Institucional da Sanquin Research. O uso de células vena saphena humanas (HVSCs) foi de acordo com o “Cód…

Representative Results

Este bioreator foi desenvolvido para estudar os efeitos individuais e combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico no crescimento do tecido vascular e remodelação em andaimes biomateriais 3D. O desenho do bioreator permite a cultivo de até oito construções vasculares sob várias condições de carregamento(Figura 1A). As construções vasculares são posicionadas em uma câmara de cultura de fluxo (Figura 1B) na qual tanto o trecho circu…

Discussion

O bioreator descrito aqui permite a avaliação sistemática das contribuições do indivíduo e efeitos combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e regeneração tecidual em andaimes tubulares resorbáveis. Essa abordagem também permite que uma grande variedade de análises sejam realizadas em construções vasculares, conforme exemplificado na seção de resultados representativos. Esses resultados mostram o impacto característico dos diferentes regimes de carregamento hemodinâ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo é apoiado financeiramente pela ZonMw como parte do programa LSH 2Treat (436001003) e da Dutch Kidney Foundation (14a2d507). N.A.K. reconhece o apoio do Conselho Europeu de Pesquisa (851960). Agradecemos o Programa de Gravitação “Regeneração Impulsionada por Materiais”, financiado pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (024.003.013).

Materials

advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM) Gibco 12491-015 cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil Julabo 8940012 prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen Sigma F8630 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin Sigma T4648 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge Eppendorf 5804 to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor – "kelly forceps" Almedic P-422 clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators Sanyo MCO-170AIC-PE for cell culturing
Compressed air reservoir Festo CRVZS-5 smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches Matlab R2017. The Mathworks, Natick, MA calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board National Instruments BNC-2090 data processing in between amplifier system and computer
Ethanol VWR VWRK4096-9005 to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS) Greiner 758087 cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet Assistant HE40567002 apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology n.a. part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax Gibco 35050061 cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera MotionScope M-5 to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens – Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 – lens Nikon JAA616AB to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip ibidi GmbH 10821 block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads ibidi GmbH 10902 set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped) Swann Morton 0301; 0933 to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software National Instruments version 2018 to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light Labconco 302310001 to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes Greiner 664-160 for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C) Sigma A8960 cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500 Zeiss Schott AG to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps ibidi GmbH various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories) to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS) PEEKEL instruments B.V. n.a. to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders ibidi GmbH 10974 medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter Rubber BV 1805 to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software Idtvision 2.15.00 to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G) BD Microlance 301700 together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver Adson 2429218 to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues Kleenex 38044001 for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm Sigma P7793-1EA quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S) Lonza DE17-602E cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-100TAB for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps Greiner 206202 to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder Festo AEVC-20-10-I-P to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length) SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands n.a. produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control) Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer BD TC-XX and P 10 EZ the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor Festo MPPES-3-1/8-2-010, 159596 provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) Gibco A1049101 cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 30120086 multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20% Sigma 5030 Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.  
Silicone O-rings Technirub 1250S to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness) Rubber BV 1805 to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL) Falcon 352095 multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle Ethicon, Johnson&Johnson EH7404H Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL) B. Braun Melsungen AG 2057932 to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm) Satorius 17597-K to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap Nunc 178983 to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap Nunc 156499 to culture static control samples
Teflon bellow Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel) PolarWare 15-248 for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers Wironit 4910 sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water Stakpure Omniapure UV 18200002 to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light Philips TUV 30W/G30 T8 for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding
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References

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Koch, S. E., van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Cuypers, L. A. B., Bulsink, J. A., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M. A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch. J. Vis. Exp. (166), e61824, doi:10.3791/61824 (2020).
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