Summary

ثقافة اكسال من الخلايا العصبية الجرذ الشبكية جانجليون مع الشم Ensheathing غليا، كنموذج في المختبر من تجديد أكسونال الكبار

Published: November 02, 2020
doi:

Summary

نقدم نموذج في المختبر لتقييم القدرة العصبية في حاسة الشم (OEG) ، بعد الإصابة العصبية. وهو يستند إلى ثقافة ثنائية من الخلايا العصبية العقدية الشبكية البالغين (RGN) على الطبقات الأحادية OEG والدراسة اللاحقة لتجديد محور عصبي ، من خلال تحليل علامات RGN المحورية وstomodendritic.

Abstract

يتم ترجمة خلايا الغليا (OEG) الشمية على طول الطريق من الغشاء المخاطي الشمي إلى وإلى طبقة العصب الشمي (ONL) من لمبة الشم. طوال حياة الكبار، فهي المفتاح لنمو محور عصبي من الخلايا العصبية الشمية التي تم إنشاؤها حديثا، من بروبريا لامينا إلى ONL. بسبب خصائصها المؤيدة للتجديد، وقد استخدمت هذه الخلايا لتعزيز تجديد محور عصبي في الحبل الشوكي أو نماذج إصابات العصب البصري.

نقدم نموذج في المختبر إلى المقايسة وقياس القدرة العصبية OEG بعد الإصابة العصبية. في هذا النموذج، يتم استزراع OEG الإنسان المتخلّف بشكل عكسي (ihOEG) باعتباره أحادي الطبقات، يتم استخراج شبكية العين من الفئران البالغة والخلايا العصبية العقدية الشبكية (RGN) على الطبقة الأحادية OEG. بعد 96 ح، يتم تحليل علامات محور عصبي وsmatodendritic في RGNs بواسطة immunofluorescence وعدد من RGNs مع محور عصبي ومتوسط طول محور عصبي / الخلايا العصبية يتم تحديد كميا.

هذا البروتوكول لديه ميزة على غيرها من المختبرات في المختبر التي تعتمد على الخلايا العصبية الجنينية أو ما بعد الولادة, أنه يقيم خصائص OEG العصبية في الأنسجة البالغة. أيضا، فإنه ليس فقط مفيدة لتقييم إمكانات العصبية التنكسية من ihOEG ولكن يمكن أن تمتد إلى مصادر مختلفة من OEG أو الخلايا الدبقية الأخرى.

Introduction

لدى الخلايا العصبية للجهاز العصبي المركزي البالغ (CNS) قدرة تجديدية محدودة بعد الإصابة أو المرض. استراتيجية مشتركة لتعزيز تجديد الجهاز العصبي المركزي هي زرع، في موقع الإصابة، من أنواع الخلايا التي تحفز نمو عصبي مثل الخلايا الجذعية، والخلايا Schwann، الفلكيات أو حاسة الشم خلايا glia (OEG)1،2،3،5.

OEG مشتق من قمةالعصبية 6 ويقع في الغشاء المخاطي الشمي وفي لمبة الشم. في البالغين، تموت الخلايا العصبية الحسية الشمية بانتظام نتيجة للتعرض البيئي ويتم استبدالها بالخلايا العصبية المتمايزة حديثًا. OEG يحيط ويوجه هذه المحاور الشمية الجديدة لدخول لمبة الشم وإنشاء نقاط الاشتباك العصبي الجديدة مع أهدافها في CNS7. بسبب هذه السمات الفسيولوجية، وقد استخدمت OEG في نماذج من إصابة الجهاز العصبي المركزي مثل الحبل الشوكي أو إصابة العصب البصري وخصائصه العصبية العصبية تصبح ثبت8،9،10،11. وقد تم تحديد عدة عوامل باعتبارها مسؤولة عن الخصائص المؤيدة للتجديد لهذه الخلايا، بما في ذلك إنتاج المصفوفة خارج الخلية proteases أو إفراز عوامل النمو العصبية والمحاورية12،13،14.

ونظرا للقيود التقنية لتوسيع الخلايا الأولية OEG، أنشأنا سابقا وتميزت عكسها الخالدة الإنسان OEG (ihOEG) خطوط clonal، والتي توفر إمدادات غير محدودة من OEG متجانسة. وتستمد خلايا ihOEG هذه من الثقافات الأولية، التي أعدت من المصابيح الشمية التي تم الحصول عليها في عمليات التشريح. وقد خلدت من قبل transduction من الوحدة الفرعية الحفازة التيلوميراز (TERT) و oncogene Bmi-1 وتعديلها مع فيروس SV40 مستضد T كبيرة15,16,17,18. اثنان من هذه ihOEG هي Ts14 ، التي تحافظ على القدرة التجديدية للثقافات الأصلية و Ts12 ، وهو خط تجديدي منخفض يستخدم كتحكم منخفض في تجديد هذه التجارب18.

لتقييم قدرة OEG على تعزيز تجديد محور عصبي بعد الإصابة العصبية ، تم تنفيذ العديد من النماذج في المختبر. في هذه النماذج، يتم تطبيق OEG على الثقافات ذات الأصل العصبي المختلفة وتشكيل نيوريت وتوسيع — استجابة لزلال coculture — يتم فحصها. أمثلة من هذه المصادر العصبية هي الخلايا العصبية القشرية الفئران حديثي الولادة19, جروح الصفر التي أجريت على الخلايا العصبية الجنينية الجرذان من الأنسجة القشرية20, الفئران شبكية العين explants21, الفئران hypothalamic أو فرس النهر الخلايا العصبية بعد الولادة22,2 3, بعد الولادة الجرذ الظهرية جذر العصبونات العقدية24, بعد الولادة الماوس كورتيكوسبينال المسالك العصبية25, الخلايا العصبية NT2 الإنسان26, أو الخلايا العصبية القشرية الدماغية بعد الولادة على ردود الفعل astrocyte الثقافات ندبة مثل27.

في هذه النماذج، ومع ذلك، يعتمد فحص التجديد على الخلايا العصبية الجنينية أو ما بعد الولادة، والتي لديها اللدونة الجوهرية التي هي غائبة في الخلايا العصبية الكبار المصابين. للتغلب على هذا العيب، نقدم نموذجا لتجديد محور عصبي الكبار في الثقافات المشتركة من خطوط OEG مع الخلايا العصبية العقدية الشبكية الكبار (RGNs)، استنادا إلى واحد وضعت أصلا Wigleyوآخرون. 28،29،30،31 وتعديلها واستخدامها من قبل مجموعتنا12،13،14، 15،16،17،18،32،33. باختصار، يتم استخراج أنسجة الشبكية من الفئران البالغة وهضمها مع papain. ثم يتم مطلي تعليق خلية الشبكية على إما الأغطية المعالجة ببوليسين أو على Ts14 و Ts12 monolayers. يتم الحفاظ على الثقافات لمدة 96 ساعة قبل أن يتم إصلاحها ثم immunofluorescence لمحور (MAP1B وNF-H البروتينات)34 وsmatodendritic (MAP2A وباء) يتم تنفيذ35 علامات. يتم تحديد كمي تجديد أكسونال كنسبة مئوية من الخلايا العصبية مع محور عصبي، فيما يتعلق مجموع السكان من RGNs ويتم حساب مؤشر تجديد محور عصبي كما متوسط طول محور عصبي لكل خلية عصبية. وهذا البروتوكول ليس مفيداً فقط لتقييم الإمكانات العصبية التنكسية للـ ihOEG، بل يمكن توسيع نطاقه ليشمل مصادر مختلفة من الخلايا الدبقية أو الخلايا الدبقية الأخرى.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجان الوطنية والمؤسسية لأخلاقيات البيولوجيا. 1. ihOEG (Ts12 و Ts14) الثقافة ملاحظة: يتم هذا الإجراء في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية لثقافة الأنسجة. إعداد 50 مل ME10 OEG ثقافة المتوسطة كما هو منصوص ع…

Representative Results

في هذا البروتوكول، نقدم نموذج في المختبر إلى فحص OEG القدرة العصبية بعد إصابة الخلايا العصبية. كما هو مبين في الشكل 1، مصدر OEG هو عكسها خلد الإنسان OEG خط الخلية النيكل -Ts14 و Ts12 – ، والتي تستمد من الثقافات الأولية ، أعدت من المصابيح الشم التي تم الحصول عليها في تشريح الجثث<sup class="xr…

Discussion

يعتبر زرع OEG في مواقع إصابات CNS علاجًا واعدًا لإصابة الجهاز العصبي المركزي بسبب خصائصه المكونة المؤيدة للأعصاب7،8،9. ومع ذلك ، اعتمادا على مصدر الأنسجة – الغشاء المخاطي الشمي (OM-OEG) مقابل لمبة الشم (OB-OEG) – أو عمر المتبرع ، يوجد اختلاف كبير في ه?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل مالياً المشروع SAF2017-82736-C2-1-R من وزيرية سيو دي سيننسيا إي إنفوكسيون إلى MTM-F ومن مؤسسة يونيفرسيداد فرانسيسكو دي فيتوريا إلى JS.

Materials

antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

References

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Play Video

Cite This Article
Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

View Video