アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての
Summary
神経損傷後の嗅覚神経再生能力(OEG)の神経再生能力を評価するインビトロモデルを発表する。これは、OEG単層上のアキソトマイズ化された直上神経節ニューロン(RGN)の共培養と、RGN軸索およびソマト樹状マーカーを分析することによって、軸索再生のその後の研究に基づいています。
Abstract
嗅覚エンシアシンググリア(OEG)細胞は、嗅粘膜から嗅球の嗅覚神経層(ONL)までずっと局在化している。成人の生涯を通じて、彼らは新たに生成された嗅覚ニューロンの軸索成長のための鍵です, ラミナプロパリアからONLに.その再生特性のために、これらの細胞は脊髄または視神経損傷モデルにおける軸索再生を促進するために使用されてきた。
神経損傷後のOEG神経再生能力をアッセイし測定するためのインビトロモデルを発表する。このモデルでは、可逆的に不死化したヒトOEG(ihOEG)は単層として培養され、レチナは成体ラットから抽出され、Retinaは、OEG単層上に共培養される。96時間後、RGNの軸索およびソマト樹状マーカーを免疫蛍光によって分析し、軸索および平均軸索長/ニューロンを有するRGNの数を定量化する。
このプロトコルは、胚性ニューロンまたは出生後ニューロンに依存する他のインビトロアッセイよりも、成人組織におけるOEG神経再生特性を評価する利点がある。また、ihOEGの神経再生電位を評価するのに有用であるだけでなく、OEGまたは他のグリア細胞の異なる供給源に拡張することができる。
Introduction
成人中枢神経系(CNS)ニューロンは、傷害または疾患後の再生能力が限られている。CNS再生を促進するための一般的な戦略は、移植、傷害部位において、幹細胞、シュワン細胞、アストロサイトまたは嗅覚グリア(OEG)細胞などの軸索成長を誘導する細胞型の1、2、3、4、5である。
OEGは神経堤6に由来し、嗅粘膜および嗅球中に位置する。成人では、嗅覚感覚ニューロンは環境暴露の結果として定期的に死に、新たに分化されたニューロンに置き換えられる。OEGは、これらの新しい嗅覚軸索を取り囲んで導き、嗅球に入り、CNS 7の目標を持つ新しいシナプスを確立します。これらの生理学的属性のために、OEGは、脊髄または視神経損傷などのCNS傷害のモデルに使用されており、その神経再生および神経保護特性が証明される8、9、10、11になる。これらの細胞の再生促進特性の原因としていくつかの因子が同定されているが、神経栄養および軸索成長因子12、13、14の細胞外マトリックスプロテアーゼ産生または分泌を含む。
主要OEG細胞を拡張するための技術的な制限を考えると、我々は以前に均質なOEGの無制限の供給を提供する可逆的不死化ヒトOEG(ihOEG)クローンラインを確立し、特徴づけた。これらのihOEG細胞は、検死で得られた嗅球から調製された一次培養物に由来する。それらは、テロメラーゼ触媒サブユニット(TERT)とオンコジーンBmi−1の導入によって不死化し、SV40ウイルス大T抗原15、16、17、18で修飾した。これらのihOEG細胞株のうちの2つはTs14であり、これは元の培養物とTs12の再生能力を維持し、これらの実験18において低再生制御として使用される低再生線である。
神経損傷後に軸索再生を促進するOEG能力を評価するために、いくつかのin vitroモデルが実装されている。これらのモデルでは、OEGは、グリアの共培養に応答して、異なるニューロン起源および神経突起の形成と伸びの培養物に適用される。このようなニューロン源の例は、新生児ラット皮質ニューロン19、皮質組織20からラット胚性ニューロンに行われた傷創傷、ラットの眼窩外植物21、ラット視床下部または海馬後のニューロン22、23、出生後ラット背側根神経節ニューロン24、出生後マウスコルチコナルトラクトニューロン25、ヒトNT2ニューロン26、または、反応性アストロサイト瘢痕様培養27上の出生後大脳皮質ニューロン。
しかし、これらのモデルでは、再生アッセイは、負傷した成体ニューロンに存在しない本質的な可塑性を有する胚性または出生後ニューロンに依存している。この欠点を克服するために、私たちは、もともとウィグリーら、28、29、30、31によって開発されたものに基づいて、成人のretinal神経節ニューロン(RG)を有するOEGラインの共存培養における成人軸索再生のモデルを提示し、我々のグループ12、13、14、15、16、17、18、32、33.簡単に言えば、レチン組織は成虫ラットから抽出され、パパインで消化される。その後、レチナル細胞懸濁液は、ポリリジン処理カバーリップまたはTs14およびTs12単層のいずれかにメッキされます。培養物は、固定される前に96時間維持され、次いで軸索(MAP1BおよびNF−Hタンパク質)34およびソマト樹状(MAP2AおよびB)35マーカーに対する免疫蛍光が行われる。軸索再生は軸索を有するニューロンの割合として定量化され、RGNおよび軸索再生指数の総集団に関しては、ニューロン当たりの平均軸索長として計算される。このプロトコルは、ihOEGの神経再生ポテンシャルを評価するのに有用であるだけでなく、OEGまたは他のグリア細胞の異なる供給源に拡張することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
CNS傷害部位でのOEG移植は、その構成的な前神経再生特性7、8、9によるCNS傷害に対する有望な治療法と考えられている。しかし、組織源(嗅覚粘膜(OM-OEG)対嗅球(OB-OEG)、またはドナーの年齢に応じて、そのような容量26、31、33、36にかなりの変動が存在する。</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、シエンシア・エ・イノバシオン大臣からMTM-F、フンダシオン・ウニバーシダード・フランシスコ・デ・ビトリアからJSへのプロジェクトSAF2017-82736-C2-1-Rによって財政的に支援されました。
Materials
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
References
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
- Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
- Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
- Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
- Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
- Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
- Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
- Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
- Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
- Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
- Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
- Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
- García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
- García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
- Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
- Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
- Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
- Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
- Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
- Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
- Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
- Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
- Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
- Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
- Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
- Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
- Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
- García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
- Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).
