Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta
Summary
Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.
Abstract
As células de glia ensheathing olfativas (OEG) são localizadas desde a mucosa olfativa até e para a camada nervosa olfativa (ONL) da lâmpada olfativa. Ao longo da vida adulta, eles são fundamentais para o crescimento axonal de neurônios olfativos recém-gerados, da lamina propria ao ONL. Devido às suas propriedades pró-regenerativas, essas células têm sido usadas para promover a regeneração axonal em modelos de lesão medular ou nervo óptico.
Apresentamos um modelo in vitro para avaliar e medir a capacidade neurorregenerativa do OEG após lesão neural. Neste modelo, o OEG humano reversivelmente imortalizado (ihOEG) é cultivado como uma monocamada, as retinas são extraídas de ratos adultos e neurônios de gânglios retinais (RGN) são coculturados na monocamada OEG. Após 96 h, marcadores axonais e somatodendritic em RGNs são analisados por imunofluorescência e o número de RGNs com axônio e o comprimento/neurônio axonal médio são quantificados.
Este protocolo tem a vantagem sobre outros ensaios in vitro que dependem de neurônios embrionários ou pós-natais, que avaliam propriedades neuroregenerativas OEG no tecido adulto. Além disso, não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenera do ihOEG, mas pode ser estendido para diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.
Introduction
Os neurônios do sistema nervoso central adulto (SNC) têm capacidade regenerativa limitada após lesão ou doença. Uma estratégia comum para promover a regeneração do SNC é o transplante, no local da lesão, de tipos celulares que induzem o crescimento axonal, como células-tronco, células schwann, astrócitos ou células ensheathing glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG deriva da crista neural6 e se localiza na mucosa olfativa e na lâmpada olfativa. No adulto, neurônios sensoriais olfativos morrem regularmente como resultado da exposição ambiental e são substituídos por neurônios recém-diferenciados. O OEG circunda e guia esses novos axônios olfativos para entrar na lâmpada olfativa e estabelecer novas sinapses com seus alvos no CNS7. Devido a esses atributos fisiológicos, o OEG tem sido utilizado em modelos de lesão de SNC, como lesão medular ou nervo óptico e suas propriedades neurorregenerativas e neuroprotetoras se tornamcomprovadas 8,9,10,11. Vários fatores foram identificados como responsáveis pelas características pró-regenerativas dessas células, incluindo a produção ou secreção de proteases de matriz extracelular ou secreção dos fatores de crescimento neurotrófico e axonal12,13,14.
Dadas as limitações técnicas para expandir as células primárias de OEG, estabelecemos e caracterizamos linhas clonais de OEG humano igênitas reversíveis (ihOEG), que fornecem um fornecimento ilimitado de OEG homogêneo. Estas células ihOEG derivam de culturas primárias, preparadas a partir de lâmpadas olfativas obtidas em autópsias. Eles foram imortalizados pela transdução da subunidade catalítica telomerase (TERT) e do oncogene Bmi-1 e modificados com o vírus SV40 grande antígeno T15,16,17,18. Duas dessas linhas celulares ihOEG são Ts14, que mantém a capacidade regenerativa das culturas originais e Ts12, uma linha regenerativa baixa que é usada como baixo controle de regeneração nesses experimentos18.
Para avaliar a capacidade de OEG para promover a regeneração axonal após lesão neural, vários modelos in vitro foram implementados. Nesses modelos, o OEG é aplicado a culturas de diferentes origens neuronais e formação de neurita e alongamento — em resposta à cocultura gliana — são avaliados. Exemplos dessas fontes neuronais são neurônios corticais neonatais de ratos19, feridas de arranhão realizadas em neurônios embrionários de ratos de tecido cortical20, explanações de retina de rato21,neurônios hipotalâmicos ou hipocampais22,23, neurônios gânglios de raiz dorsal de rato pós-natal24, neurônios do trato corticospinal do camundongo pós-natal25, neurônios NT2 humanos26, ou neurônios corticais cerebrais pós-natal em culturas de cicatriz de astrócito reativas27.
Nesses modelos, no entanto, o ensaio de regeneração conta com neurônios embrionários ou pós-natais, que têm uma plasticidade intrínseca que está ausente em neurônios adultos feridos. Para superar essa desvantagem, apresentamos um modelo de regeneração axonal adulta em coculturas de linhas de OEG com neurônios gânglios de retina adulta (RGNs), baseado no originalmente desenvolvido por Wigley et al.28,29,30,31 e modificados e usados pelo nosso grupo12,13,14,15,16,17,18,32,33. Resumidamente, o tecido retiniano é extraído de ratos adultos e digerido com papain. A suspensão das células de retina é então banhada em deslizamentos tratados com polilise ou em monocamadas Ts14 e Ts12. As culturas são mantidas por 96 h antes de serem fixadas e, em seguida, a imunofluorescência para proteínas axona (MAP1B e NF-H)34 e somatodendritic (MAP2A e B)35 marcadores são realizados. A regeneração axonal é quantificada como uma porcentagem de neurônios com axônio, em relação à população total de RGNs e o índice de regeneração axonal é calculado como o comprimento axonal médio por neurônio. Este protocolo não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenerativo do IhOEG, mas pode ser estendido a diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O transplante de OEG em locais de lesão do CNS é considerado uma terapia promissora para lesão do CNS devido às suas propriedades pró-neuroregenerativas constitutivas7,8,9. No entanto, dependendo da fonte de tecido — mucosa olfativa (OM-OEG) versus lâmpada olfativa (OB-OEG)— ou a idade do doador, existe uma variação considerável nessa capacidade26,31,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projeto SAF2017-82736-C2-1-R do Ministerio de Ciencia e Innovación para o MTM-F e pela Fundación Universidad Francisco de Vitória ao JS.
Materials
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
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