Vi presenterer en in vitro modell for å vurdere olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative kapasitet, etter neural skade. Den er basert på en coculture av akotomiserte voksne retinal ganglion nevroner (RGN) på OEG monolayers og påfølgende studie av aksonal regenerering, ved å analysere RGN aksonale og somatodendritiske markører.
Olfactory ensheathing glia (OEG) celler er lokalisert hele veien fra olfactory mucosa til og inn i olfactory nerve lag (ONL) av olfactory pære. Gjennom hele voksenlivet er de nøkkelen til aksonal dyrking av nygenererte olfaktoriske nevroner, fra lamina propria til ONL. På grunn av deres pro-regenerative egenskaper har disse cellene blitt brukt til å fremme aksonal regenerering i ryggmargen eller optiske nerveskademodeller.
Vi presenterer en in vitro modell for å analysere og måle OEG nevroregenerativ kapasitet etter nevrale skader. I denne modellen er reversibel udødeliggjort menneskelig OEG (ihOEG) dyrket som monolayer, netthinnen ekstraheres fra voksne rotter og retinal ganglion nevroner (RGN) er cocultured på OEG monolayer. Etter 96 timer analyseres aksonære og somatodendrittiske markører i RGN-er ved immunofluorescence og antall RGN-er med akson og gjennomsnittlig aksonal lengde/nevron kvantifiseres.
Denne protokollen har fordelen over andre in vitro-analyser som er avhengige av embryonale eller postnatale nevroner, at den evaluerer OEG neuroregenerative egenskaper i voksenvev. Det er heller ikke bare nyttig for å vurdere det neuroregenerative potensialet til ihOEG, men kan utvides til forskjellige kilder til OEG eller andre glialceller.
Voksne sentralnervesystemet (CNS) nevroner har begrenset regenerativ kapasitet etter skade eller sykdom. En vanlig strategi for å fremme CNS regenerering er transplantasjon, på skadestedet, av celletyper som induserer aksonal vekst som stamceller, Schwann-celler, astrocytter eller olfaktoriske ensheathing glia (OEG)celler 1,2,3,4,5.
OEG kommer fra nevrale crest6 og lokaliserer i olfaktorisk slimhinne og i olfactory pære. Hos voksne dør olfaktoriske sensoriske nevroner regelmessig som følge av miljøeksponering, og de erstattes av nylig differensierte nevroner. OEG omgir og guider disse nye olfaktoriske aksonene for å gå inn i olfaktorisk pære og å etablere nye synapser med sine mål i CNS7. På grunn av disse fysiologiske egenskapene har OEG blitt brukt i modeller av CNS-skade som ryggmarg eller optisk nerveskade og dens nevroregenerative og nevrobeskyttende egenskaper blir bevist8,9,10,11. Flere faktorer har blitt identifisert som ansvarlig for de pro-regenerative egenskapene til disse cellene, inkludert ekstracellulær matrise proteaser produksjon eller sekresjon av nevrotrofiske og aksonalevekstfaktorer 12,13,14.
Gitt de tekniske begrensningene for å utvide primære OEG-celler, har vi tidligere etablert og karakterisert reversibel udødeliggjort menneskelig OEG (ihOEG) kloniske linjer, som gir en ubegrenset tilførsel av homogen OEG. Disse ihOEG cellene stammer fra primære kulturer, utarbeidet av olfaktoriske pærer oppnådd i obduksjoner. De ble udødeliggjort ved transduksjon av telomerase katalytisk underenhet (TERT) og onkogen Bmi-1 og modifisert med SV40-viruset stort T antigen15,16,17,18. To av disse ihOEG cellelinjer er Ts14, som opprettholder regenerativ kapasitet av de opprinnelige kulturer og Ts12, en lav regenerativ linje som brukes som en lav regenereringskontroll i disse eksperimentene18.
For å vurdere OEG kapasitet til å fremme aksonær regenerering etter nevrale skader, har flere in vitro-modeller blitt implementert. I disse modellene brukes OEG på kulturer av forskjellig nevronal opprinnelse og neurittdannelse og forlengelse – som svar på glialkokultur – analyseres. Eksempler på slike nevronale kilder er neonatal rottekortikale nevroner19, scratch sår utført på rotte embryonale nevroner fra kortikaltvev 20, rotte retinal explants21, rotte hypothalamus eller hippocampal postnatal nevroner22,23, postnatal rotte dorsal rot ganglion nevroner24, postnatal mus kortikospinalkanal nevroner25, menneskelige NT2 nevroner26, eller postnatal cerebral kortikale nevroner på reaktiv astrocytt arr-lignende kulturer27.
I disse modellene er regenereringsanalysen imidlertid avhengig av embryonale eller postnatale nevroner, som har en iboende plastisitet som er fraværende i skadede voksne nevroner. For å overvinne denne ulempen, vi presentere en modell av voksen aksonal regenerering i cocultures av OEG linjer med voksen retinal ganglion nevroner (RGNs), basert på den som opprinnelig ble utviklet av Wigley et al.28,29,30,31 og modifisert og brukes av vår gruppe12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kort, retinal vev ekstraheres fra voksne rotter og fordøyd med papain. Retinal celle suspensjon er deretter belagt på enten polylysin-behandlet coverslips eller på Ts14 og Ts12 monolayers. Kulturer opprettholdes i 96 timer før de er faste og deretter immunofluorescence for aksonære (MAP1B og NF-H proteiner)34 og somatodendritic (MAP2A og B)35 markører utføres. Aksonal regenerering kvantifiseres som en prosentandel av nevroner med akson, med hensyn til den totale populasjonen av RGN-er og aksonær regenereringsindeks beregnes som gjennomsnittlig aksonal lengde per nevron. Denne protokollen er ikke bare nyttig for å vurdere det neuroregenerative potensialet til ihOEG, men kan utvides til forskjellige kilder til OEG eller andre glialceller.
OEG transplantasjon på CNS skade steder regnes som en lovende terapi for CNS skade på grunn av sin utspekulerende pro-neuroregenerative egenskaper7,8,9. Men, avhengig av vevskilden- olfaktorisk slimhinne (OM-OEG) versus olfaktorisk pære (OB-OEG) – eller donorens alder, finnes det betydelig variasjon i en slik kapasitet26,31,33,<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av prosjektet SAF2017-82736-C2-1-R fra Ministerio de Ciencia e Innovación til MTM-F og av Fundación Universidad Francisco de Vitoria til JS.
antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
PBS | Home made | ||
PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |