Summary
La colorazione immunoistochimica e il sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S (gene rRNA 16S) sono stati eseguiti al fine di scoprire e distinguere i batteri nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi in situ. Le differenze compositiva e funzionale dei batteri sono state previste utilizzando BugBase e Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).
Abstract
La teoria di un tratto riproduttivo superiore femminile "sterile" ha incontrato una crescente opposizione a causa dei progressi nel rilevamento batterico. Tuttavia, se le ovaie contengono batteri non è stato ancora confermato. Qui è stato introdotto un esperimento per rilevare i batteri nei tessuti ovarici. Abbiamo scelto pazienti con cancro ovarico nel gruppo oncologico e pazienti non cancerose nel gruppo di controllo. Il sequenziamento del gene rRNA 16S è stato utilizzato per differenziare i batteri nei tessuti ovarici dal cancro e dai gruppi di controllo. Inoltre, abbiamo previsto la composizione funzionale dei batteri identificati utilizzando BugBase e PICRUSt. Questo metodo può essere utilizzato anche in altri visceri e tessuti poiché molti organi hanno dimostrato di ospitare batteri negli ultimi anni. La presenza di batteri nei visceri e nei tessuti può aiutare gli scienziati a valutare i tessuti cancerosi e normali e può essere di aiuto nel trattamento del cancro.
Introduction
Recentemente, è stato pubblicato un numero crescente di articoli che dimostrano l'esistenza di batteri nei visceri solidi addominali, come il rene, la milza, il fegato e l'ovaio1,2. Geller et al. hanno trovato batteri nei tumori pancreatici e questi batteri erano resistenti alla gemcitabina, un farmaco chemioterapico2. S. Manfredo Vieira et al. hanno concluso che Enterococcus gallinarum era portatile ai linfonodi, al fegato e alla milza e poteva guidare l'autoimmunità3.
Poiché la cervice svolge un ruolo di difensore, i batteri nel tratto riproduttivo femminile superiore, che contiene l'utero, le tube di Falloppio e le ovaie, sono stati minimamente studiati. Tuttavia, alcune nuove teorie sono state stabilite negli ultimi anni. I batteri possono avere accesso alla cavità uterina durante il ciclo mestruale a causa di cambiamenti nelle mucine4,5. Inoltre, Zervomanolakis et al. hanno confermato che l'utero, insieme alle tube di Falloppio, è una pompa peristaltica controllata dal sistema endocrino delle ovaie e questa disposizione consente ai batteri di entrare nell'endometrio, nelle tube di Falloppio e nelle ovaie6.
Il tratto riproduttivo superiore non è più un mistero grazie allo sviluppo di metodi di rilevamento batterico. Verstraelen et al. hanno utilizzato un metodo di sequenziamento accoppiato con codice a barre per scoprire i batteri uterini prendendo di mira la regione ipervariabile V1-2 del gene RNA 16S7. Fang et al. hanno impiegato il sequenziamento con codice a barre in pazienti con polipi endometriali e hanno rivelato la presenza di diversi batteri intrauterini8. Inoltre, utilizzando il gene RNA 16S, Miles et al. e Chen et al. hanno trovato batteri nel sistema genitale di donne che erano sottoposte a salpingo-ovariectomia e isterectomia, rispettivamente5,9.
I batteri nei tessuti tumorali hanno guadagnato crescente attenzione negli ultimi anni. Banerjee et al. hanno scoperto che la firma del microbioma differiva tra le pazienti con cancro ovarico e i controlli10. Unnoxynatronum sibiricum è stato associato allo stadio tumorale e Methanosarcina vacuolata potrebbe essere usato per diagnosticare il cancro ovarico11. Oltre al cancro ovarico, altri tumori, come stomaco, polmone, prostata, seno, cervice ed endometrio, hanno dimostrato di essere associati ai batteri12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. hanno proposto una nuova classe di diagnostica oncologica basata su microbi, prevedendo lo screening del cancro in fase iniziale19. In questo protocollo, abbiamo studiato le differenze tra tessuti ovarici cancerosi e normali confrontando la composizione e la funzione dei batteri in questi due tessuti.
La colorazione immunoistochimica e il sequenziamento del gene rRNA 16S sono stati eseguiti per confermare la presenza di batteri nelle ovaie. Sono state studiate le differenze e le funzioni previste dei batteri ovarici nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi. I risultati hanno mostrato l'esistenza di batteri nei tessuti ovarici. Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata erano correlati rispettivamente allo stadio e alla diagnosi di cancro ovarico. Sono stati confrontati quarantasei percorsi KEGG significativamente diversi che erano presenti in entrambi i gruppi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Medico Istituzionale del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Xi'an Jiaotong (No. XJTUIAF2018LSK-139). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti arruolati.
1. Criteri per l'ingresso nel gruppo oncologico e nel gruppo di controllo
- Per il gruppo di cancro, arruolare pazienti a cui viene diagnosticato principalmente il cancro ovarico e, dopo laparotomia, è dimostrato che hanno un cancro ovarico sieroso da reperti patologici.
- Per il gruppo di controllo, arruolare pazienti a cui viene diagnosticato principalmente un mioma uterino o un'adenomiosi uterina, senza presentare alcuna condizione ovarica e che hanno subito isterectomia e salpingo-ovariectomia.
NOTA: questo standard non è definito. Possono essere arruolati anche pazienti con malattie che non colpiscono le ovaie che si sottopongono a isterectomia e salpingo-ovariectomia. - Escludere i pazienti con uno o più dei seguenti criteri:
Donne incinte o che allattano.
Assunzione di antibiotici 2 mesi prima dell'intervento chirurgico.
Avere febbre o marcatori infiammatori elevati.
Avere infiammazioni di qualsiasi tipo.
Aver subito la chemioterapia neoadiuvante.
2. Raccogli campioni
- Durante l'intervento chirurgico, posizionare le ovaie resecate in un tubo sterile e posizionare il tubo in azoto liquido per il trasporto. Evitare di toccare qualsiasi altra cosa durante l'intera procedura.
- Separare le ovaie in campioni di tessuto di circa 1 cm di spessore con un paio di nuove pinzette sterili sotto un armadio a flusso laminare. Dopo la separazione, conservare i campioni a -80 °C.
NOTA: Tutte le procedure per la raccolta dei campioni sono asettiche, compresa la separazione delle ovaie.
3. Sequenziare il gene rRNA 16S
- Estrarre il DNA.
- Aggiungere 1,2 mL di tampone EX inibitore in un tubo centrifugo da 2 mL. Quindi, aggiungere 180-220 mg di campioni nel tubo. Lasciare mescolare completamente il campione (70 °C a bagnomaria per 5 minuti e poi vortice per 15 s).
- Centrifugare il tubo per 1 min a 600 x g.
- Posizionare 550 μL del surnatante in un nuovo tubo da 1,5 mL e centrifugare per 1 minuto a 600 x g.
- Trasferire 400 μL del surnatante con 30 μL di proteinasi K in un altro tubo da 1,5 mL.
- Aggiungere 400 μL di buffer AL e utilizzare un miscelatore a vortice per 15 s.
- Incubare a 70 °C per 10 min.
- Aggiungere 400 μL di alcol al 96-100%. Utilizzare un mixer a vortice per 15 s.
- Trasferire 600 μL di miscela in una colonna di assorbimento e centrifugare per 1 minuto a 13700 g. Sostituire il tubo inferiore. Ripetere questo passaggio 11 volte.
- Aggiungere 500 μL di tampone AW1, centrifugare per 1 minuto a 13.700 x g e cambiare il tubo inferiore.
- Aggiungere 500 μL di tampone AW2, centrifugare per 3 minuti a 13.700 x g e cambiare il tubo inferiore.
- Centrifuga per 3 min a 13.700 x g.
- Trasferire la miscela in un nuovo tubo da 1,5 mL, aggiungere 200 μL di tampone ATE, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e centrifugare per 1 minuto a 13.700 x g.
- Test di qualità. Utilizzare l'elettroforesi su gel di sefarosi all'1% per testare la qualità. Aggiungere 400 ng di campione, 120 V, 30 minuti. Risultato ideale: concentrazione di DNA: ≥ 10 ng/μL, purezza del DNA: A260/A280 = 1,8-2,0, DNA lordo: ≥ 300 ng.
- Preparare le librerie utilizzando un kit di sequenziamento metagenomico 16S secondo il protocollo del produttore.
- Eseguire la PCR. In breve, ogni reazione PCR da 25 μL contiene 12,5 ng di DNA campione come input, 12,5 μL di 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix e 5 μL di ciascun primer a 1 μM.
- Effettuare la PCR utilizzando il seguente protocollo: una fase iniziale di denaturazione eseguita a 95°C per 3 min seguita da 25 cicli di denaturazione (95°C, 30 s), ricottura (55°C, 30 s) ed estensione (72°C, 30 s), e un allungamento finale di 5 min a 72°C.
- Pulire il prodotto PCR dalla miscela di reazione con perle magnetiche utilizzando le istruzioni del produttore.
- Ripetere i passaggi 3.3.1 e 3.3.2.
- Test di qualità. Fare riferimento al passaggio 3.2.
- Ripetere il passaggio 3.3.3.
- Test di qualità. Utilizzare l'elettroforesi su gel di sefarosio all'1% per testare l'impurità, uno spettrofotometro per testare la purezza, un fluorometro per testare la concentrazione e un kit di analisi dell'RNA per testare l'integrità. Seguire il protocollo del produttore. Normalizzare e mettere in comune le librerie; quindi sequenza (2 x 300 bp paired-end read setting) utilizzando celle a flusso standard V3 a 600 cicli, producendo circa 100.000 letture di base 2 x 300.
NOTA: Le sequenze di primer a lunghezza intera: 16S Amplicon polymerase chain reaction (PCR) Forward primer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] e 16S Amplicon PCR Primer inverso: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. Analizza i dati di sequenziamento del gene rRNA 16S
- Filtra le letture grezze di ogni campione in base alla qualità del sequenziamento con il pacchetto software QIIME 2-20180220.
- Copiare tre file nella directory: emp-paired-end-sequences_01
un file forward.fastq.gz che contiene la sequenza forward legge,
un file reverse..gz che contiene la sequenza inversa legge,
un file barcodes.fastq.gz che contiene le letture dei codici a barre associate - Eseguire
qiime tools import \
--type EMPPairedEndSequences \
--input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
- Copiare tre file nella directory: emp-paired-end-sequences_01
- Rimuovere le sequenze di primer e adattatore.
qiime cutadapt trim-paired \
--i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGGGG \
--p-front-r GCTACGGGGGG \
--p-error-rate 0 \
--quality-cutoff 25 \
--o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
--verboso - Accorciare le letture della sequenza in cui entrambe le qualità di estremità accoppiate sono inferiori a 25. Vedi sopra --quality-cutoff 25
- Analizzare i dati di sequenziazione.
- Raccogli sequenze per formare unità tassonomiche operative (OTU) con un cutoff di somiglianza al 97%.
qiime vsearch dereplicate-sequences \
--i-sequences trimmed-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-table table_04.qza \
--o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
--i-table table_04.qza \
--i-sequences rep-seqs_04.qza \
--i-reference-sequences 97_otus.qza \
--p-perc-identity 0,97 \
--o-clustered-table table-cr-97.qza \
--o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
--o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza - Per le OTA, calcolare l'abbondanza relativa in ciascun campione. Le informazioni sull'abbondanza sono in table-cr-97.qza
- Raccogli sequenze per formare unità tassonomiche operative (OTU) con un cutoff di somiglianza al 97%.
- Utilizzare un classificatore bayesiano nativo, che mira al set di formazione RDP (versione 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), per ordinare tutte le sequenze. Le informazioni sui taxon mappati sono in table-cr-97.qza
- All'interno dell'OTU data, assegnare una classificazione che rifletta la maggiore coerenza delle sequenze alle OTU. Quindi, allineare le OTA. Vedere table-cr-97.qza e rep-seqs-cr-97.qza
- Sulla base delle informazioni del gruppo campione, eseguire la diversità alfa (inclusi gli indici Chao 1, ACE, Shannon, Simpson e Evenness) e l'analisi delle coordinate principali basata su UniFrac (PCoA).
qiime strumenti esportazione \
--input-path table-cr-97.qza \
--output-path exported-feature-table
exported-feature-table
qiime diversità alfa \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-metrico observed_otus \
--o-alpha-diversity observed_otus_vector.qza
qiime diversità beta \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-metrica braycurtis \
--o-matrice di distanza unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Prevedere la funzione batterica
- Per prevedere la rappresentazione correlata delle caratteristiche dei batteri, utilizzare BugBase21. La tabella OTU di input per BugBase viene preparata utilizzando i seguenti comandi.
biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
NOTA: La previsione si basa su sei categorie di fenotipi (Ward et al. non pubblicati) (https://bugbase.cs.umn.edu/): colorazione di Gram, tolleranza all'ossigeno, capacità di formare biofilm, contenuto di elementi mobili, patogenicità e tolleranza allo stress ossidativo. - Predire la composizione funzionale di un metagenoma da picrust con l'uso di dati genetici marcatori e un database contenente genomi di riferimento22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt - Analizza le differenze di funzioni tra ogni gruppo con l'aiuto di STAMP23,24. Si prega di fare riferimento alle citazioni per utilizzare il software.
6. Dati
- Utilizzare un software statistico per calcolare la significatività dei risultati. L'indicazione della significatività statistica deve essere impostata come P < 0,05.
- Valuta le differenze di età e parità con il t-test dello studente. Valutare le differenze nello stato della menopausa, la storia di ipertensione e diabete dal test del chi quadrato. Valutare le differenze nel numero di taxa batterici ovarici dal test Mann-Whitney U.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pazienti
Un totale di 16 pazienti qualificati sono stati inclusi nello studio. Il gruppo di controllo comprendeva 10 donne con una diagnosi di tumore uterino benigno (tra queste, a 3 pazienti è stato diagnosticato un mioma uterino e a 7 pazienti è stata diagnosticata l'adenomiosi uterina). Nel frattempo, il gruppo oncologico conteneva 6 donne con una diagnosi di carcinoma ovarico sieroso (tra queste, a 2 pazienti è stato diagnosticato lo stadio II e a 2 di loro è stato diagnosticato lo stadio III). Le seguenti caratteristiche non hanno mostrato differenze tra i pazienti del gruppo di controllo e del gruppo oncologico: età, stato della menopausa, parità, storia di ipertensione e storia di diabete (Tabella 1).
Tabella 1: Statistiche dei pazienti Fare clic qui per scaricare questa tabella.
La ricchezza e la varietà delle specie batteriche ovariche in entrambi i gruppi
La presenza di batteri che utilizzano la colorazione immunoistochimica è stata mostrata nella Figura 1. La diversità alfa dei microbi è stata analizzata come metodo per rilevare la ricchezza e la varietà delle specie batteriche ovariche. Il numero di specie osservate nei tessuti del cancro ovarico era inferiore a quello del gruppo di controllo, senza differenze significative. La ricchezza (rappresentata dall'indice Chao 1 e ACE) e la diversità (rappresentata dall'indice Shannon, Simpson e Evenness) delle specie batteriche non erano entrambe significativamente diverse tra il gruppo tumorale e il gruppo di controllo (Figura 2).
Figura 2: Il sequenziamento del gene rRNA 16S mostra differenze tra il cancro e i gruppi di controllo in ricchezza e diversità batterica. (A) Indice di specie osservate (P = 0,06, test Mann-Whitney U); (B) Indice Chao 1 (P = 0,06, test U di Mann-Whitney); (C) indice ACE (P = 0,06, test U di Mann-Whitney); (D) Indice di Shannon (P = 0,32, test U di Mann-Whitney; E. Indice di uniformità (P = 0,48, test U di Mann-Whitney); (F) Indice di Simpson (P = 0,46, test U di Mann-Whitney). Abbiamo ottenuto il permesso di ristampa da editori precedenti. Questa figura è stata modificata da Wang et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Descrizione dei batteri ovarici
Il sequenziamento profondo della regione genica dell'rRNA V3-V4 16S è stato eseguito su tutti i campioni per ottenere una migliore comprensione dei batteri ovarici. I risultati hanno mostrato che i proteobatteri erano il phylum più abbondante (67,10% nel gruppo di controllo e 67,20% nel gruppo cancro), Firmicutes era il secondo phylum più abbondante (23,77% nel gruppo di controllo e 23,82% nel gruppo cancero) e il terzo phylum più abbondante era Bacteroidetes (3,26% nel gruppo di controllo e 3,41% nel gruppo cancro). Analizzando le specie del gruppo di controllo, la composizione principale era costituita da Halobacteroides halobios (14,53%), seguito da Gemmata obscuriglobus (11,07%) e Methyloprofundus sedimenti (10,69%). Per il gruppo oncologico, Gemmata obscuriglobus è stata la più ricca del cluster (13,89%), seguita da Halobacteroides halobius (11,99%) e Methyloprofundus sedimenti (11,12%) (Figura 3).
Figura 3: Abbondanza relativa di phyla (> 1%) e delle prime 12 specie nei campioni ovarici. (A) L'abbondanza relativa del phyla (> 1%) nelle ovaie dei pazienti nel gruppo di controllo. (B) L'abbondanza relativa del phyla (> 1%) nelle ovaie di pazienti con carcinoma ovarico. (C) L'abbondanza relativa delle 12 specie batteriche più abbondanti nelle ovaie dei pazienti di controllo. (D) L'abbondanza relativa delle 12 specie batteriche più abbondanti nelle ovaie delle pazienti con cancro ovarico. Abbiamo ottenuto il permesso di ristampa da editori precedenti. Questa figura è stata modificata da Wang et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Diverse composizioni di batteri ovarici tra i due gruppi
Un confronto tra diverse comunità batteriche è stato effettuato da PCoA utilizzando PERMANOVA. I risultati hanno mostrato che i batteri nel gruppo di controllo differivano da quelli del gruppo cancro, P < 0,05 (Figura 4).
Figura 4: PCoA rileva gruppi di comunità e le relative abbondanze di Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata. (A) Le comunità sono state raggruppate utilizzando PCoA. PC1 e PC2 sono tracciati sugli assi x e y. Il blocco rosso indica un campione nel gruppo del cancro ovarico. Il cerchio blu indica un campione nel gruppo di controllo. I campioni del gruppo di cancro ovarico sono stati separati da altri campioni nel gruppo di controllo. (B) Comunità raggruppate utilizzando PCoA. PC1 e PC2 sono tracciati sugli assi x e y. Il blocco rosso indica un campione nel gruppo del cancro ovarico. Il cerchio solido blu indica un campione di una paziente con mioma uterino e il cerchio cavo blu è uguale a un campione di un paziente con adenomiosi uterina. (C) L'abbondanza relativa di Anoxynatronum sibiricum (gruppo di controllo: n = 10, gruppo di cancro: n = 6, P = 0,034, test di Mann-Whitney U). (D) L'abbondanza relativa di Methanosarcina vacuolata (gruppo di controllo: n = 10, gruppo di cancro: n = 6, P = 0,001, test U di Mann-Whitney). Abbiamo ottenuto il permesso di ristampa da editori precedenti. Questa figura è stata modificata da Wang et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Composizione batterica ovarica nel cancro e nei gruppi di controllo da diverse prospettive
Un'analisi della composizione batterica ovarica è stata eseguita da diverse prospettive per rilevare ulteriormente le differenze nei batteri ovarici identificati. Nella Tabella 2sono stati considerati i livelli di phylum, classe, ordine, famiglia, genere e specie e le statistiche sono fornite nel grafico. In particolare, c'era un'associazione tra l'abbondanza relativa di Anoxynatronum sibiricum e lo stadio del tumore, e Methanosarcina vacuolata era un segno specifico nella diagnosi del cancro ovarico (Tabella 2).
Conservazione fenotipica dei batteri ovarici nei due gruppi in base alle funzioni previste
Nel gruppo canceroso, l'espressione di geni correlati a fenotipi potenzialmente patogeni e ossidativi tolleranti allo stress è stata aumentata rispetto a quella del gruppo di controllo (Wilcoxon signed-rank test, P =0,02 e P =0,002). Non è stata trovata alcuna differenza significativa tra il cancro ovarico e i gruppi di controllo nei seguenti aspetti: i fenotipi dei batteri aerobici, anaerobici, facoltativamente anaerobici, gram-positivi e gram-negativi; elementi mobili; e formazione di biofilm dei batteri ovarici (Figura 5). Sono state determinate quarantasei varianti di percorsi KEGG tra i batteri nelle ovaie nei gruppi di cancro e di controllo. Le ovaie nel gruppo cancro hanno mostrato 26 percorsi aumentati. Tra questi, i percorsi più altamente correlati erano i trasportatori. D'altra parte, i batteri nel tessuto tumorale ovarico hanno mostrato 20 percorsi ridotti. Le funzioni più rilevanti erano le seguenti: sistema di secrezione, funzioni sconosciute e sistema bicomponente. Il resto dei percorsi sono mostrati nella Figura 6.
Figura 1: Espressione immunoistochimica LPS nelle ovaie. (A) Gruppo di controllo (10 x). Barre di scala, 200 μm. (B) Gruppo di controllo (40 x). Barre di scala, 50 μm. (C) Gruppo di cancro (10x). Barre di scala, 200 μm. (D) Gruppo cancro (40 x). Barre di scala, 50 μm. Le frecce indicano la colorazione LPS nel tessuto ovarico. Abbiamo ottenuto il permesso di ristampa da editori precedenti. Questa figura è stata modificata da Wang et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Metagenomi previsti analizzati da BugBase. L'espressione di alcuni geni nel gruppo del cancro è stata aumentata rispetto a quella nel gruppo di controllo. Questi geni erano correlati a fenotipi potenzialmente patogeni (Wilcoxon signed-rank test, P = 0,02) e ossidativi resistenti allo stress delle ovaie. (Wilcoxon signed-rank test, P = 0,002). Abbiamo ottenuto il permesso di ristampa da editori precedenti. Questa figura è stata modificata da Wang et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi PICRUSt di diversi percorsi KEGG tra il cancro e i gruppi di controllo. Abbiamo ottenuto il permesso di ristampa da editori precedenti. Questa figura è stata modificata da Wang et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 2: Ricchezza (rappresentata dall'indice Chao 1 e ACE) e diversità (rappresentata dall'indice Shannon, Simpson e Evenness) delle specie batteriche Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il cancro ovarico ha una notevole influenza sulla fertilità delle donne25. La maggior parte delle pazienti con cancro ovarico viene diagnosticata in fasi avanzate e il tasso di sopravvivenza a 5 anni è inferiore al 30%18. È stata pubblicata la conferma dei batteri nei visceri solidi addominali, tra cui fegato, pancreas e milza. L'esistenza di batteri nel tratto riproduttivo femminile superiore si verifica perché la cervice non è racchiusa2,3,4,5. Tuttavia, se le ovaie, che sono visceri solidi addominali, sono sterili o meno non è stato ancora determinato. Inoltre, se i batteri nelle ovaie sono legati al cancro ovarico è anche una domanda importante.
Le differenze significative nei batteri che abbiamo trovato sono state confrontate tra diversi gruppi. Tutte le procedure sopra menzionate erano rigorosamente privo di germi, inclusi strumenti, reagenti, attrezzature e il funzionamento dell'intero protocollo. Ancora più importante, abbiamo usato le ovaie di pazienti con malattia uterina benigna come gruppo di controllo per contrastare la possibile contaminazione. Tuttavia, in questo protocollo, la contaminazione non può essere evitata. Pertanto, poiché il gruppo di cancro e il gruppo di controllo sono stati analizzati nello stesso ambiente sperimentale, semplicemente confrontando le differenze tra questi due gruppi, abbiamo potuto ottenere prove primarie sull'origine microbiologica del cancro ovarico.
I risultati dei batteri nel tessuto ovarico potrebbero iniziare un nuovo campo che studia i batteri che influenzano il cancro ovarico. Inoltre, la presenza e la composizione uniche dei batteri nei tessuti ovarici cancerosi potrebbero dirigere la carcinogenesi del cancro ovarico e gli obiettivi terapeutici e prognostici dei batteri. Tra le 46 vie KEGG, le funzioni legate alla biosintesi degli antibiotici del gruppo vancomicina hanno attirato particolare attenzione. Questo può fornire ulteriori opzioni di trattamento per il cancro ovarico.
Tuttavia, il protocollo aveva alcune limitazioni. In primo luogo, i campioni non potevano essere raccolti da persone sane per motivi etici. Il gruppo di controllo era ovaie di pazienti con malattia uterina benigna (incluso mioma uterino e adenomiosi). In secondo luogo, il numero di campioni dovrebbe essere maggiore. La dimensione limitata del campione dello studio potrebbe ostacolare l'accuratezza dei risultati. In terzo luogo, sebbene il gruppo di cancro e il gruppo di controllo fossero nelle stesse condizioni, non c'erano controlli negativi o positivi. Inoltre, la contaminazione non poteva essere evitata. Ad oggi, lo studio dei batteri ovarici in pazienti con cancro ovarico è ancora in una fase iniziale. È necessario uno studio su larga scala con più campioni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Clinical Research Award del First Affiliated Hospital della Xi'an Jiaotong University, Cina (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), dal Major Basic Research Project of Natural Science and Technology Department of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), dal Key Research and Development Project del Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), dallo Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) e il progetto di ricerca medica del piano di orientamento allo sviluppo sociale di Xi'an (2017117SF / YX011-3). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Ringraziamo i colleghi del Dipartimento di Ginecologia del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Xi'an Jiaotong per il loro contributo alla raccolta dei campioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
