यह प्रोटोकॉल एक ही प्रक्रिया में मानव आंत के वसा से व्यवहार्य एडिपोसाइट्स और स्ट्रोमल संवहनी अंश-एसवीएफ कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक कुशल कोलेजनेज पाचन विधि प्रदान करता है, जिसमें प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए कई झिल्ली-बाध्य मार्करों के धुंधला के माध्यम से एडिपोसाइट्स और एसवीएफ-मैक्रोफेज के फेनोटाइपिंग से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करने के लिए कार्यप्रणाली शामिल है।
आंत का वसा ऊतक (वैट) एक सक्रिय चयापचय अंग है जो मुख्य रूप से परिपक्व एडिपोसाइट्स और स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) कोशिकाओं से बना होता है, जो विभिन्न बायोएक्टिव अणुओं को छोड़ते हैं जो चयापचय, हार्मोनल और प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं; वर्तमान में, यह स्पष्ट नहीं है कि इन प्रक्रियाओं को वसा ऊतक के भीतर कैसे विनियमित किया जाता है। इसलिए, वसा ऊतक के पैथोफिज़ियोलॉजी में प्रत्येक कोशिका आबादी के योगदान का मूल्यांकन करने वाले तरीकों का विकास महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल अलगाव चरणों का वर्णन करता है और एक ही प्रक्रिया में मानव वैट बायोप्सी से व्यवहार्य परिपक्व एडिपोसाइट्स और एसवीएफ के कुशल अलगाव के लिए आवश्यक समस्या निवारण दिशानिर्देश प्रदान करता है, एक कोलेजनेज एंजाइमेटिक पाचन तकनीक का उपयोग करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल भी मैक्रोफेज सबसेट की पहचान करने और जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए परिपक्व adipocyte शाही सेना अलगाव प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित है, जो इन सेल आबादी के बीच बातचीत विदारक अध्ययन प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. संक्षेप में, वैट बायोप्सी को धोया जाता है, यंत्रवत् कीमा बनाया जाता है, और एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए पचाया जाता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, परिपक्व एडिपोसाइट्स को एसवीएफ गोली से प्लवनशीलता द्वारा अलग किया जाता है। शाही सेना निष्कर्षण प्रोटोकॉल बहाव अभिव्यक्ति assays के लिए adipocytes से कुल शाही सेना (miRNAs सहित) की एक उच्च उपज सुनिश्चित करता है. इसके साथ ही, एसवीएफ कोशिकाओं का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से मैक्रोफेज सबसेट (समर्थक और विरोधी भड़काऊ फेनोटाइप) को चिह्नित करने के लिए किया जाता है।
सफेद वसा ऊतक न केवल वसा कोशिकाओं या एडिपोसाइट्स से बना होता है, बल्कि एक गैर-वसा कोशिका अंश भी होता है जिसे स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) के रूप में जाना जाता है, जिसमें मैक्रोफेज में एक विषम कोशिका आबादी होती है, अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं नियामक टी कोशिकाओं (ट्रेग्स) के रूप में, और ईोसिनोफिल, प्रीडिपोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स, संवहनी और संयोजी ऊतक 1,2 से घिरे होते हैं. वसा ऊतक (एटी) अब एक अंग है कि एडीपोकिन्स, साइटोकिन्स, और microRNAs के माध्यम से चयापचय और सूजन से संबंधित शारीरिक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है और ऊतक में विभिन्न कोशिकाओं द्वारा जारी किया जाता है, autocrine, paracrine, और अंतःस्रावी प्रभाव 3,4 के साथ. मनुष्यों में, सफेद वसा ऊतक चमड़े के नीचे वसा ऊतक (सैट) और आंत वसा ऊतक (वैट), उन 2,5 के बीच महत्वपूर्ण शारीरिक शारीरिक, आणविक, सेलुलर और शारीरिक अंतर के साथ शामिल हैं. सैट मानव एटी के 80% तक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि वैट पेट की गुहा के भीतर स्थित है, मुख्य रूप से मेसेंटरी और ओमेंटम में, चयापचय रूप सेअधिक सक्रिय 6. इसके अलावा, वैट एक अंतःस्रावी अंग है जो शरीर के वजन, इंसुलिन संवेदनशीलता, लिपिड चयापचय और सूजन पर पर्याप्त प्रभाव के साथ मध्यस्थों को गुप्त करता है। नतीजतन, वैट संचय पेट मोटापा और मोटापे से संबंधित बीमारियों जैसे टाइप -2 मधुमेह, चयापचय सिंड्रोम, उच्च रक्तचाप, और हृदय रोग के जोखिम की ओर जाता है, जो मोटापे से जुड़ेमृत्यु दर 6,7,8,9के बेहतर भविष्यवक्ता का प्रतिनिधित्व करता है।
होमोस्टैटिक स्थितियों में, एडिपोसाइट्स, मैक्रोफेज और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं विरोधी भड़काऊ मध्यस्थों के स्राव के माध्यम से वैट चयापचय को बनाए रखने के लिए सहयोग करती हैं10. हालांकि, अत्यधिक वैट विस्तार सक्रिय टी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं और मैक्रोफेज की भर्ती को बढ़ावा देता है। वास्तव में, दुबला वैट में, मैक्रोफेज का अनुपात 5% है, जबकि यह अनुपात मोटापे में 50% तक बढ़ जाता है, मैक्रोफेज ध्रुवीकरण विरोधी भड़काऊ से प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप तक, एक पुरानी भड़काऊ वातावरण10,11उत्पन्न करता है।
मोटापा महामारी का एक परिणाम के रूप में, रिपोर्ट की एक आश्चर्यजनक संख्या विभिन्न वैट अनुसंधान विषयों को संबोधित उत्पन्न हुई है, एडिपोसाइट जीव विज्ञान सहित, epigenetics, सूजन, अंतःस्रावी गुण, और बाह्य पुटिकाओं के रूप में उभरते क्षेत्रों,दूसरों के बीच 8,10,12,13. हालांकि, वैट पर्यावरण adipocytes और निवासी या आने मैक्रोफेज के बीच crossstock द्वारा परिभाषित किया गया है, हालांकि सबसे अध्ययन केवल एक सेल आबादी पर ध्यान केंद्रित किया है, और वैट और उनके रोगजनक परिणामों11,14 में इन कोशिकाओं की बातचीत के बारे में दुर्लभ जानकारी है. इसके अलावा, एटी में एडिपोसाइट-मैक्रोफेज इंटरप्ले को संबोधित करने वाले मूल्यवान अध्ययन सेल लाइनों का उपयोग करके किए गए थे, जिसमें विवो प्राइमिंग स्थितियों 11,14,15की कमी थी। वैट में इन कोशिकाओं की बातचीत या विशेष योगदान को विच्छेदन करने के लिए एक उपयुक्त रणनीति को एक ही वसा बायोप्सी से दोनों सेल प्रकारों के अलगाव की आवश्यकता होती है ताकि इन विट्रो परख में प्रदर्शन किया जा सके जो वैट चयापचय को नियंत्रित करने वाले विवो गुणों में यथासंभव दर्पण करता है।
हालांकि एटी को तोड़ने के लिए यांत्रिक बलों पर आधारित गैर-एंजाइमेटिक पृथक्करण विधियां न्यूनतम हेरफेर सुनिश्चित करती हैं, इन विधियों का उपयोग नहीं किया जा सकता है यदि उद्देश्य एसवीएफ कोशिकाओं का अध्ययन करना है, क्योंकि उनके पास एंजाइमी तरीकों की तुलना में सेल रिकवरी और कम सेल व्यवहार्यता में कम दक्षता है, और ऊतक की एक बड़ी मात्रा16,17 की आवश्यकता है. कोलेजन का उपयोग एंजाइमी पाचन एक सौम्य विधि है जो डब्ल्यूएटी18 जैसे रेशेदार ऊतकों के कोलेजन और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के पर्याप्त पाचन की अनुमति देता है और अक्सर इसका उपयोग तब किया जाता है जब ट्रिप्सिन अप्रभावी या हानिकारकहोता है 19. प्रोटोकॉल एक ही प्रक्रिया में मानव वैट बायोप्सी से व्यवहार्य परिपक्व आदिपोसाइट्स और एसवीएफ कोशिकाओं के कुशल अलगाव के लिए मौलिक समस्या निवारण दिशानिर्देश प्रदान करता है, एक कोलेजनेज एंजाइमेटिक पाचन तकनीक का उपयोग करके, उच्च पैदावार (मात्रा, शुद्धता और अखंडता) सुनिश्चित करने के लिए जानकारी देता है। इसके साथ ही, प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री20 द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए कई झिल्ली-बाध्य मार्करों के धुंधला के माध्यम से एसवीएफ कोशिकाओं से मैक्रोफेज सबसेट की पहचान करने के लिए अनुकूलित है।
वैट चयापचय विनियमन और सूजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मोटापे से जुड़ी पुरानी सूजन में एडिपोसाइट्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका में बढ़ती रुचि ने एटी में मौजूद एसवीएफ और वसा कोशिकाओं को अलग…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को Instituto Nacional de Perinatologia (अनुदान संख्या: 3300-11402-01-575-17 और 212250-3210-21002-06-15) और CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (अनुदान संख्या 2015-3-2-61661) से समर्थित किया गया था।
0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | – |
2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | – |
Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | – |
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
Baker | – | – | 250 ml, non sterile |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | – |
Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
Dissecting forceps | – | – | Steel, serrated jaws and round ends |
Dissection tray | – | – | Stainless steel |
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | – |
FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | – |
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | – |
FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | – |
Manual cell counter | – | – | – |
Mayo dissecting scisors | – | – | Stainless steel |
Microcentrifuge | – | – | Adjustable temperature |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | – |
Orbital shaker | – | – | Adjustable temperature and speed |
P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | – |
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
Pipette controller | – | – | – |
Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
Refrigerated centrifuge | – | – | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
Sterile Specimen container | – | – | – |
Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
Tube racks | – | – | For different tube sizes |
Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | – |