Isolering av levedyktige adipocytter og stromalvaskulær fraksjon fra humant visceralt fettvev egnet for RNA-analyse og makrofagfenotyping

Summary

Denne protokollen gir en effektiv kollagenasefordøyelsesmetode for isolering av levedyktige adipocytter og stromale vaskulære fraksjon-SVF-celler fra humant visceralt fett i en enkelt prosess, inkludert metodikk for å oppnå høyverdig RNA fra adipocytter og fenotypifisering av SVF-makrofager gjennom farging av flere membranbundne markører for analyse ved flowcytometri.

Abstract

Visceralt fettvev (VAT) er et aktivt metabolsk organ som hovedsakelig består av modne adipocytter og stromale vaskulære fraksjonsceller (SVF), som frigjør forskjellige bioaktive molekyler som styrer metabolske, hormonelle og immunprosesser; Foreløpig er det uklart hvordan disse prosessene reguleres i fettvevet. Derfor er utviklingen av metoder som evaluerer bidraget fra hver cellepopulasjon til patofysiologien til fettvev avgjørende. Denne protokollen beskriver isolasjonstrinnene og gir de nødvendige feilsøkingsretningslinjene for effektiv isolering av levedyktige modne adipocytter og SVF fra humane VAT-biopsier i en enkelt prosess, ved hjelp av en enzymatisk fordøyelsesteknikk for kollagenase. Videre er protokollen også optimalisert for å identifisere makrofagundergrupper og utføre moden adipocyt-RNA-isolasjon for genuttrykksstudier, noe som gjør det mulig å utføre studier som dissekerer samspillet mellom disse cellepopulasjonene. Kort fortalt vaskes momsbiopsier, hakkes mekanisk og fordøyes for å generere en enkeltcellesuspensjon. Etter sentrifugering isoleres modne adipocytter ved flotasjon fra SVF-pelleten. RNA-ekstraksjonsprotokollen sikrer et høyt utbytte av totalt RNA (inkludert miRNA) fra adipocytter for nedstrøms ekspresjonsanalyser. Samtidig brukes SVF-celler til å karakterisere makrofagundergrupper (pro- og antiinflammatorisk fenotype) gjennom flowcytometrianalyse.

Introduction

Hvitt fettvev består ikke bare av fettceller eller adipocytter, men også av en ikke-fettcellefraksjon kjent som stromal vaskulær fraksjon (SVF), som inneholder en heterogen cellepopulasjon bestående av makrofager, andre immunceller som regulatoriske T-celler (Tregs), og eosinofiler, preadipocytter og fibroblaster, omgitt av vaskulært og bindevev ^1,2. Fettvev (AT) regnes nå som et organ som regulerer fysiologiske prosesser relatert til metabolisme og betennelse gjennom adipokiner, cytokiner og mikroRNA produsert og frigjort av forskjellige celler i vevet, med autokrine, parakrine og endokrine effekter ^3,4. Hos mennesker omfatter hvitt fettvev det subkutane fettvevet (SAT) og det viscerale fettvevet (MVA), med viktige anatomiske, molekylære, cellulære og fysiologiske forskjeller mellom dem ^2,5. SAT representerer opptil 80% av human AT, mens moms ligger i bukhulen, hovedsakelig i mesenteri og omentum, og er metabolsk mer aktiv⁶. Videre er moms et endokrint organ som utskiller mediatorer med betydelig innvirkning på kroppsvekt, insulinfølsomhet, lipidmetabolisme og betennelse. Følgelig fører momsakkumulering til abdominal fedme og fedmerelaterte sykdommer som type-2 diabetes, metabolsk syndrom, hypertensjon og kardiovaskulær sykdomsrisiko, noe som representerer en bedre prediktor for fedmeassosiert dødelighet 6,7,8,9.

Under homeostatiske forhold samarbeider adipocytter, makrofager og de andre immuncellene for å opprettholde momsmetabolismen gjennom utskillelse av antiinflammatoriske mediatorer¹⁰. Imidlertid fremmer overdreven momsutvidelse rekrutteringen av aktiverte T-celler, NK-celler og makrofager. Faktisk, i magert moms, er forholdet mellom makrofagene 5%, mens dette forholdet stiger opp til 50% i fedme, med makrofagpolarisering fra antiinflammatorisk til proinflammatorisk fenotype, og genererer et kronisk inflammatorisk miljø^10,11.

Som en konsekvens av fedmepandemien har det oppstått et forbløffende antall rapporter som omhandler ulike momsforskningsemner, inkludert adipocytbiologi, epigenetikk, betennelse, endokrine egenskaper og nye områder som ekstracellulære vesikler, blant annet 8,10,12,13. Men selv om merverdiavgiftsmiljøet er definert av krysssnakk mellom adipocytter og de fastboende eller ankommende makrofagene, har de fleste studier fokusert på bare én cellepopulasjon, og det er lite informasjon om samspillet mellom disse cellene i merverdiavgift og deres patofysiologiske konsekvenser ^11,14. Videre ble verdifulle studier som adresserte adipocytt-makrofag-samspillet i AT utført ved bruk av cellelinjer, uten in vivo primingbetingelser 11,14,15. En egnet strategi for å dissekere samspillet eller det spesielle bidraget fra disse cellene i merverdiavgift krever isolering av begge celletyper fra samme fettbiopsi for å utføre in vitro-analyser som speiler så like in vivo-egenskapene som regulerer momsmetabolismen.

Selv om de ikke-enzymatiske dissosiasjonsmetodene basert på mekaniske krefter for å bryte AT, sikrer minimal manipulasjon, kan disse metodene ikke brukes hvis målet er å studere SVF-celler, da de har lavere effektivitet i celleutvinning og lav celle levedyktighet sammenlignet med enzymatiske metoder, og et større volum vev er nødvendig^16,17. Enzymatisk fordøyelse ved bruk av kollagenase er en mild metode som tillater tilstrekkelig fordøyelse av kollagen og ekstracellulære matriksproteiner av fibrøst vev som WAT¹⁸ og brukes ofte når trypsin er ineffektivt eller skadelig¹⁹. Protokollen gir grunnleggende feilsøkingsretningslinjer for effektiv isolering av levedyktige modne adipocytter og SVF-celler fra humane VAT-biopsier i en enkelt prosess, ved hjelp av en kollagenase-enzymatisk fordøyelsesteknikk, og gir informasjon for å sikre høye utbytter (mengde, renhet og integritet) av totalt RNA fra modne adipocytter, inkludert mikroRNA, for nedstrøms ekspresjonsapplikasjoner. Samtidig er protokollen optimalisert for å identifisere makrofagundergrupper fra SVF-celler gjennom farging av flere membranbundne markører for videre analyse ved flowcytometri²⁰.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av IRB ved Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Det var frivillig å delta, og alle de påmeldte kvinnene signerte informert samtykke. 1. Visceral fettvevssamling Få momsbiopsier gjennom delvis omentektomi under keisersnitt fra friske voksne kvinner med singleton svangerskap på sikt uten arbeidskraft. Etter livmorlukking og hemostase, fortsett å identifisere større omentum og utvide det på en våt komprimering. A…

Representative Results

Denne protokollen beskriver en enzymatisk metode ved bruk av kollagenasefordøyelse etterfulgt av differensiell sentrifugering for å isolere, i en enkelt prosess, levedyktige modne adipocytter og SVF-celler fra momsbiopsier oppnådd fra friske gravide kvinner etter delvis omentektomi. I dette tilfellet bruker vi adipocytter for RNA-ekstraksjon og SVF for makrofagfenotyping. RNA-ekstraksjonsprotokollen gjorde det mulig å oppnå RNA med tilstrekkelig renhet, høy integritet og mikroRNA fra mod…

Discussion

Moms spiller en avgjørende rolle i metabolsk regulering og betennelse. Økende interesse for rollen som adipocytter og immunceller i kronisk betennelse forbundet med fedme har ført til utvikling av ulike teknikker for å skille SVF og fettceller tilstede i AT. Imidlertid tillater de fleste teknikker ikke å oppnå disse to forskjellige settene av celler som er levedyktige for nedstrøms applikasjoner fra samme momsbiopsi i en enkelt prosedyre, noe som kan være avgjørende for studier angående interaksjoner mellom adi…

Materials

0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes	Corning	CLS4101-50EA	Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip	Axygen	T-200-Y-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	–
2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube	Corning	352003	Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	–
Agilent Small RNA Kit	Agilent	5067-1548	–
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody	BioLegend	325620	0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker	–	–	250 ml, non sterile
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station	Agilent	5065-9951	–
Collagenase type II	Gibco	17101-015	Powder
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Powder
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps	–	–	Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray	–	–	Stainless steel
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	–
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	–
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences	648282	–
FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA	–
Manual cell counter	–	–	–
Mayo dissecting scisors	–	–	Stainless steel
Microcentrifuge	–	–	Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP	–
Orbital shaker	–	–	Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 to 200 μL
PCR tube storage rack	Axygen	R96PCRFSP	–
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307608	0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304016	0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller	–	–	–
Red Blood Cells Lysis Buffer	Roche	11 814 389 001	For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge	–	–	Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container	–	–	–
Transfer pipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Sterile
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0.4% Solution
Tube racks	–	–	For different tube sizes
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	–