Detta protokoll ger en effektiv kollagenasnedbrytningsmetod för isolering av livskraftiga adipocyter och stromala vaskulära fraktions-SVF-celler från humant visceralt fett i en enda process, inklusive metodik för att erhålla högkvalitativt RNA från adipocyter och fenotypifiering av SVF-makrofager genom färgning av flera membranbundna markörer för analys med flödescytometri.
Visceral fettvävnad (VAT) är ett aktivt metaboliskt organ som huvudsakligen består av mogna adipocyter och stromala vaskulära fraktionsceller (SVF), som frisätter olika bioaktiva molekyler som styr metaboliska, hormonella och immunprocesser; För närvarande är det oklart hur dessa processer regleras i fettväven. Därför är utvecklingen av metoder som utvärderar varje cellpopulations bidrag till fettvävnadens patofysiologi avgörande. Detta protokoll beskriver isoleringsstegen och ger nödvändiga felsökningsriktlinjer för effektiv isolering av livskraftiga mogna adipocyter och SVF från humana momsbiopsier i en enda process, med hjälp av en kollagenasenzymatisk matsmältningsteknik. Dessutom är protokollet också optimerat för att identifiera makrofagundergrupper och utföra mogen adipocyt-RNA-isolering för genuttrycksstudier, vilket gör det möjligt att utföra studier som dissekerar interaktionen mellan dessa cellpopulationer. Kortfattat tvättas momsbiopsier, mals mekaniskt och smälts för att generera en encellssuspension. Efter centrifugering isoleras mogna adipocyter genom flotation från SVF-pelleten. RNA-extraktionsprotokollet säkerställer ett högt utbyte av totalt RNA (inklusive miRNA) från adipocyter för nedströms uttrycksanalyser. Samtidigt används SVF-celler för att karakterisera makrofagundergrupper (pro- och antiinflammatorisk fenotyp) genom flödescytometrianalys.
Vit fettvävnad består inte bara av fettceller eller adipocyter, utan också av en icke-fettcellsfraktion som kallas stromal vaskulär fraktion (SVF), som innehåller en heterogen cellpopulation bestående av makrofager, andra immunceller som regulatoriska T-celler (Tregs) och eosinofiler, preadipocyter och fibroblaster, omgivna av kärl- och bindväv 1,2. Fettvävnad (AT) anses nu vara ett organ som reglerar fysiologiska processer relaterade till metabolism och inflammation genom adipokiner, cytokiner och mikroRNA som produceras och frisätts av olika celler i vävnaden, med autokrina, parakrina och endokrina effekter 3,4. Hos människor omfattar vit fettvävnad den subkutana fettvävnaden (SAT) och den viscerala fettvävnaden (VAT), med viktiga anatomiska, molekylära, cellulära och fysiologiska skillnader mellan dem 2,5. SAT representerar upp till 80 % av humant AT, medan moms ligger i bukhålan, främst i tarmkäxet och omentum, och är metabolisktmer aktiv. Dessutom är moms ett endokrint organ som utsöndrar mediatorer med en betydande inverkan på kroppsvikt, insulinkänslighet, lipidmetabolism och inflammation. Följaktligen leder momsackumulering till bukfetma och fetmarelaterade sjukdomar som typ 2-diabetes, metabolt syndrom, högt blodtryck och risk för hjärt- och kärlsjukdomar, vilket representerar en bättre prediktor för fetmarelaterad dödlighet 6,7,8,9.
Vid homeostatiska förhållanden samarbetar fettceller, makrofager och de andra immuncellerna för att upprätthålla momsmetabolismen genom utsöndring av antiinflammatoriska mediatorer10. En alltför stor momsexpansion främjar dock rekryteringen av aktiverade T-celler, NK-celler och makrofager. Faktum är att i mager moms är förhållandet mellan makrofagerna 5 %, medan detta förhållande stiger upp till 50 % vid fetma, med makrofagpolarisering från antiinflammatorisk till proinflammatorisk fenotyp, vilket genererar en kronisk inflammatorisk miljö10,11.
Som en konsekvens av fetmapandemin har ett häpnadsväckande antal rapporter uppstått som behandlar olika forskningsämnen, inklusive adipocytbiologi, epigenetik, inflammation, endokrina egenskaper och framväxande områden som extracellulära vesiklar, bland annat 8,10,12,13. Men även om momsmiljön definieras av överhörning mellan adipocyter och de bofasta eller anländande makrofagerna, har de flesta studier fokuserat på endast en cellpopulation, och det finns lite information om interaktionen mellan dessa celler i moms och deras patofysiologiska konsekvenser11,14. Dessutom utfördes värdefulla studier som behandlade samspelet mellan adipocyter och makrofager i AT med hjälp av cellinjer, som saknade in vivo-primingförhållandena 11,14,15. En lämplig strategi för att dissekera dessa cellers interaktion eller särskilda bidrag till mervärdesskatt kräver isolering av båda celltyperna från samma fettbiopsi för att utföra in vitro-analyser som så lika som möjligt återspeglar de in vivo-egenskaper som reglerar momsmetabolismen.
Även om de icke-enzymatiska dissociationsmetoderna baserade på mekaniska krafter för att bryta AT säkerställer minimal manipulation, kan dessa metoder inte användas om syftet är att studera SVF-celler, eftersom de har lägre effektivitet i cellåterhämtning och låg cellviabilitet jämfört med enzymatiska metoder, och en större vävnadsvolym behövs16,17. Enzymatisk nedbrytning med kollagenas är en skonsam metod som möjliggör adekvat nedbrytning av kollagen och extracellulära matrisproteiner i fibrösa vävnader såsom WAT18 och används ofta när trypsin är ineffektivt eller skadligt19. Protokollet ger grundläggande felsökningsriktlinjer för effektiv isolering av livskraftiga mogna adipocyter och SVF-celler från humana momsbiopsier i en enda process, med hjälp av en kollagenasenzymatisk nedbrytningsteknik, vilket ger information för att säkerställa höga utbyten (kvantitet, renhet och integritet) av totalt RNA från mogna adipocyter, inklusive mikroRNA, för nedströms uttrycksapplikationer. Samtidigt optimeras protokollet för att identifiera makrofagundergrupper från SVF-celler genom färgning av flera membranbundna markörer för vidare analys med flödescytometri20.
Moms spelar en avgörande roll i metabolisk reglering och inflammation. Ett ökat intresse för fettcellernas och immuncellernas roll i den kroniska inflammation som är förknippad med fetma har lett till utvecklingen av olika tekniker för att separera SVF och fettceller som finns i AT. De flesta tekniker gör det dock inte möjligt att erhålla dessa två olika uppsättningar av celler som är livskraftiga för nedströmstillämpningar från samma momsbiopsi i en enda procedur, vilket kan vara avgörande för studier …
The authors have nothing to disclose.
Denna studie finansierades av Instituto Nacional de Perinatologia (bidragsnummer: 3300-11402-01-575-17 och 212250-3210-21002-06-15) och CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (anslagsnummer 2015-3-2-61661).
0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | – |
2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | – |
Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | – |
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
Baker | – | – | 250 ml, non sterile |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | – |
Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
Dissecting forceps | – | – | Steel, serrated jaws and round ends |
Dissection tray | – | – | Stainless steel |
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | – |
FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | – |
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | – |
FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | – |
Manual cell counter | – | – | – |
Mayo dissecting scisors | – | – | Stainless steel |
Microcentrifuge | – | – | Adjustable temperature |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | – |
Orbital shaker | – | – | Adjustable temperature and speed |
P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | – |
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
Pipette controller | – | – | – |
Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
Refrigerated centrifuge | – | – | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
Sterile Specimen container | – | – | – |
Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
Tube racks | – | – | For different tube sizes |
Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | – |