Summary
В этом исследовании мы представляем протокол дифференциации нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных только стимуляцией импульса прямого тока (DC) в микрофлюидной системе.
Abstract
Физиологические электрические поля (EF) играют жизненно важную роль в миграции клеток, дифференциации, деление и смерть. В этой статье описывается система микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток с использованием микроскопии. Микрофлюидная система состоит из следующих основных компонентов: оптически прозрачный электротактический чип, прозрачный иллюминатор олова (ITO), культурный медиа-заправочный насос, электроприбор, высокочастотный усилитель мощности, мультиплексер EF, программируемый моторизованный электроприбор X-Y-Я и перевернутый фазово-контрастный микроскоп, оснащенный цифровой камерой. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. Эта работа включает в себя дифференциацию нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных стимуляцией импульса прямого тока (DC). В среде обслуживания стволовых клеток, мышь NPC (mNPCs) дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты после стимуляции пульса DC. Результаты показывают, что простое лечение пульса DC может контролировать судьбу mNPCs и может быть использован для разработки терапевтических стратегий для расстройства нервной системы. Система может быть использована для клеточной культуры в нескольких каналах, для долгосрочной стимуляции EF, для клеточного морфологического наблюдения, и для автоматического приобретения изображений замедленного действия. Эта микрофлюидная система не только сокращает необходимое экспериментальное время, но и повышает точность управления микроокниронией.
Introduction
Нейронные клетки-предшественники (NPC, также известный как нервные стволовые клетки и клетки-предшественники) может быть в качестве перспективного кандидата для нейродегенеративной терапевтическойстратегии 1. Недифференцированные NPC имеют способность к самообна роуклюре, мульти-потенции и пролиферативнойспособности 2,3. Предыдущее исследование сообщило, что внеклеточная матрица и молекулярные посредники регулируют дифференциацию NPC. Эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) способствуют распространению NPC, тем самым сохраняя недифференцированноесостояние 4.
Предыдущие исследования сообщили, что электрическая стимуляция может регулировать клеточной физиологическойдеятельности, такие как разделение 5,миграция 6,7,8, дифференциация1,9,10, иклеточной смерти 11. Электрические поля (ЭФ) играют жизненно важную роль в развитии и регенерации развития центральнойнервной системы 12,13,14. С 2009 по 2019 год эта лаборатория исследовала клеточные реакции на применение ЭФ в микрофлюиднойсистеме 1,6,7,8,15,16,17. Многоканальный, оптически прозрачный, электротаксийный (MOE) чип был разработан, чтобы быть пригодным для иммунофлуоресценции окрашивания для конфокальной микроскопии. Чип имел высокую оптическую прозрачность и хорошую долговечность и позволил одновременно провести три независимых эксперимента стимуляции и несколько иммунолабилитных условий в одном исследовании. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. В настоящем документе описывается развитие системы микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование и изготовление чипа МЧС
- Нарисуйте шаблоны для отдельных слоев полиметилметилата (PMMA) и двустороннюю ленту с использованиемсоответствующего программного обеспечения (рисунок 1A, Таблица материалов). Вырезать как PMMA листов и двусторонняя лента с CO2 лазерной машины писец (Рисунок 1B).
- Включите лазерныйписец CO 2 и подключите его к персониного компьютера. Откройте разработанный файл шаблона с помощью программного обеспечения.
- Поместите листы PMMA (275 мм х 400 мм) или двустороннюю ленту (210 мм х 297 мм) на платформу лазерного писца(рисунок 2A). Сосредоточьте лазер на поверхности листов PMMA или двустороннюю ленту с помощью инструмента автофокусировки.
- Выберите лазерный писец в качестве принтера, а затем "распечатайте" шаблон с помощью лазерного писца, чтобы начать прямую абляцию на листе PMMA или двустороннюю ленту и получить отдельные узоры на листе PMMA или ленте(рисунок 2B).
- Снимите защитную пленку с листов PMMA и очистите поверхность с помощью азотного газа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок шаблона PMMA и прямая обработка листа PMMA были выполнены в соответствии с предыдущим докладом17. - Для склеивания нескольких слоев листов PMMA сложите три куска 1 мм листов PMMA (Слои 1, 2 и 3) и свяжете их под давлением 5кг/см 2 в тепловом бондере в течение 30 минут при 110 градусах по Цельсию, чтобы сформировать сборку каналапотока/электрической стимуляции (рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные партии коммерчески полученного листа PMMA имеют несколько иную температуру перехода стекла (Tg). Оптимальная температура связи должна быть проверена на 5 градусов по Цельсию шагом близко к Tg. - Придерживайтесь 12 частей адаптеров к отдельным отверстиям в слое 1 сборки чипов MOE с быстро действующим клеем цианоакрилата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптеры сделаны из PMMA путем инъекций литья. Плоские поверхности внизу для подключения к чипу МЧС. Адаптеры подшипника 1/4W-28 женский винт нить для подключения белых пальцев-жесткие пробки, плоские нижние разъемы, или адаптеры Luer. Будьте осторожны при использовании быстро действующего клея цианоакрилата. Избегайте брызг в глаза. - Дезинфицировать 1 мм PMMA субстраты (слои 1-3), двусторонняя лента (слой 4), и 3 мм оптический класс PMMA (слой 5) с использованием ультрафиолетового (УФ) облучения в течение 30 минут перед сборкой чипа (Рисунок 1A).
- Придерживайтесь 1 мм субстратов PMMA (Layers 1-3) на 3 мм оптическом классе PMMA (слой 5) с двусторонним лентой (слой 4) для завершения сборки PMMA (Слои 1-5) (Рисунок 1A).
- Подготовь чистое стекло крышки для сборки на чипе.
- Заполните десятикратное разбавление моющего средства в окрашивание банку (см. таблицу материалов), и очистить крышку стекла в этом моющее средство с помощью ультразвукового очистителя в течение 15 минут.
- Тщательно промыть окрашивание банку под проточной водопроводной водой, чтобы удалить все следы моющего средства.
- Продолжить полоскания дистиллированной водой, чтобы удалить все следы водопроводной воды, и повторить шаг 1.7.2 два раза.
- Высушите очищенное стекло крышки, продув его азотным газом.
- Дезинфицировать сборку PMMA (Layers 1-5), двустороннюю ленту (слой 6) и стекло крышки (слой 7) с помощью УФ-облучения внутри шкафа биобезопасности в течение 30 минут перед сборкой чипа(рисунок 1A).
- Приклейте очищенное стекло крышки (слой 7) к сборке PMMA (Слои 1-5) с двусторонним лентой (слой 6) (Рисунок 1A).
- Инкубировать чип МЧС в вакуумной камере на ночь; использовать сборку чипов МЧС для последующих процедур(рисунок 3).
2. Покрытие поли-L-лизина (PLL) на субстрате в регионах клеточной культуры
- Подготовка политетрафторэтилен трубки, плоский нижний разъем, конус разъем, конус-Люер адаптер, белый палец-жесткий штепсельная вилка (также называемый пробкой), Luer адаптер, Luer замок шприц, и черный резиновый bung (Рисунок 4A, Таблица материалов). Стерилизовать все вышеперечисленные компоненты в автоклаве при 121 градусе по Цельсию в течение 30 минут.
- Печать отверстия агар моста адаптеры ( Рисунок1A) с белыми пальцами герметики пробки. Подключите разъем с плоским дном к сборке чипов MOE с помощью средних адаптеров входных и розетки(рисунок 4B). Подключите адаптер конуса-Люера к 3-путь стопкоукс.
- Добавьте 2 мл 0,01% PLL раствора с помощью 3 мл шприца, который подключается к 3-путь стопкок среднего входе(рисунок 4B-
). - Подключите пустой 3 мл шприца к 3-путь стопкок средней розетки(рисунок 4B-
). - Заполните регионы культуры клеток решением PLL. Вручную медленно перекачив раствор покрытия туда-сюда. Закройте два 3-путь stopcocks, чтобы запечатать решение внутри культуры регионов.
- Инкубировать чип МЧС при 37 градусов по Цельсию на ночь в инкубаторе заполнены 5% CO2 атмосферы.
).
).3. Подготовка сети соляных мостов
- Следуя шагу 2.6, откройте два 3-путь stopcocks и смыть пузырьки в каналах вручную накачки покрытия раствор вперед и назад в канале с помощью двух шприцев.
- Нарисуйте 3 мл полной среды (среда обслуживания стволовых клеток, состоящая из модифицированной смеси Dulbecco's medium/Ham F-12 (DMEM/F12), 2% B-27 дополнения, 20 нг/мл EGF и 20 нг/мл bFGF) в шприц 3 мл, который соединяется с 3-путь стопкок среднего входе(рисунок 4B- и рисунок 4B-
). - Добавьте 3 мл полной среды, чтобы заменить раствор покрытия в регионах клеточной культуры. Подключите пустой 5 мл шприц к 3-путь стопкок средней розетки(рисунок 4B-
). - Подготовка сети соляных мостов(рисунок 5).
- Вырезать черный каучук bung производить разрыв, и вставить серебро (Ag)/серебряный хлорид (AgCl) электроды через черный резиновый bung и в шприц блокировки Luer (Рисунок 4A).
- Замените белую палец на адаптер Luer и ввезу 3% горячей агарозы для заполнения адаптера Luer.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления горячей агарозы растворите 3 г порошка агарозы в 100 мл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) и стерилизовать в автоклаве при 121 градусе по Цельсию в течение 30 мин. - Подключите шприц блокировки Luer к адаптеру Luer. Введать 3% горячей агарозы через черную резиновую bung для заполнения шприца luer блокировки с помощью шприца с иглой. Разрешить от 10 до 20 минут для агарозы, чтобы остыть и затвердеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы увеличить объемную емкость агарозы, шприц luer lock устанавливается на адаптер Luer(рисунок 4 и рисунок 5). Затем большие электроды вставляются в шприц блокировки Luer. Электрод способен обеспечить стабильную электрическую стимуляцию для долгосрочного эксперимента.
).
).4. Подготовка мНПЦ
- Культура mNPCs1 в полной среде в колбе культуры клеток 25T при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе, наполненном 5% CO2 атмосферы. Субкультура клеток каждые 3-4 дня, и выполнять все эксперименты с клетками, которые прошли 3-8 проходов из первоначального источника.
- Перенесите подвеску клетки в коническую трубку 15 мл и вращай нейросферы при 100 × в течение 5 минут. Аспирировать супернатант, и мыть нейросферы с 1x Dulbecco PBS (DPBS). Спин-вниз нейросферы на 100 × в течение 5 мин.
- Аспирировать 1x DPBS, а затем повторно нейросферы в полной среде. Тщательно и нежно перемешать.
- Добавьте 1 мл нейросферной подвески с помощью шприца 1 мл, который подключается к 3-й стопкок розетки(рисунок 4B- ).
5. Настройка микрофлюидной системы для стимуляции пульса DC(рисунок 6)
- Установите чип MOE, посеянный на ячейке, на прозрачный обогреватель ITO, который крепится на программируемой моторизованной сцене X-Y-Я.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура поверхности ITO контролируется пропорционально-интегральным производным контроллером и поддерживается при температуре 37 градусов по Цельсию. Термокополь K-типа зажимается между чипом и нагревателем ITO для мониторинга температуры регионов клеточной культуры внутри чипа. Чип MOE установлен на программируемой моторизованной сцене X-Y-Я и подходит для автоматического получения изображений замедленного действия на отдельных участках канала. Изготовление обогревателя ITO и установка системы отопления культуры ячейки были описаны ранее18,19. - Наполнить mNPCs ручной накачкой в чип МЧС через средний выход. Инкубировать сотовый чип МЧС на 37 C ITO нагреватель для 4 ч.
- После 4 ч, насос полной среды через чип МЧС через средний вход со скоростью потока 20 йл / ч с помощью шприца насоса.
ПРИМЕЧАНИЕ: MNPCs выращиваются и поддерживаются в чипе в течение дополнительных 24 ч до стимуляции EF, чтобы позволить вложение клеток и роста. Отходы жидкости собирается в пустой 5 мл шприц подключен к 3-путь стопкок розетки, показано, как "отходы" на рисунке 6A. Конфигурация микрофлюидной системы МЧС показана на рисунке 6. Эта микрофлюидная система обеспечивает непрерывную подачу питания в клетки. Полная свежая среда постоянно закачивается в чип MOE для поддержания постоянного значения рН. Таким образом, клетки могут быть откоуты вне инкубатора CO2. - Используйте электрические провода для подключения мультиплексера EF к чипу MOE с помощью электродов Ag/AgCl на чипе. Подключите мультиплексер EF и генератор функций к усилителю для вывода импульсов квадратной волны DC с величиной 300 мВ/мм с частотой 100 Гц при 50% циклов службы (50% времени и 50% времени)(рисунок 6B).
- Подключите электрические провода к мультиплексеру EF. Подключите электрические провода к чипу МЧС с помощью электродов Ag/AgCl.
- Подключите мультиплексер EF к усилителю с помощью электрических проводов. Подключите генератор функций к усилителю и цифровому осциллоскопу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мультиплексер EF - это схема, которая включает в себя неуступность камеры культуры в цепи и соединяет все отдельные камеры в параллельной электронной сети. Каждая из трех культурных камер электрически соединена в последовательном с переменным резистором (Vr) и амметром (показан как ЗА на рисунке 6A)в мультиплексере. Электрический ток через каждую культурную камеру разливается, контролируя Vr, и ток отображается на соответствующем амметре. Сила электрического поля в каждом регионе клеточной культуры была рассчитана законом Ома, I qEA, где я электрический ток, σ (установлен как 1.38S'm -1 для DMEM/F1220) является электрической проводимостью среды культуры, E является электрическим полем, и A является поперечной областью электротаксической камеры. Для измерения региона клеточной культуры, показанного на рисунке 1,электрический ток составляет 87 мА и 44 мА для пульса постоянного тока и постоянного тока при 50% цикле службы, соответственно.
- Подай мНПЦ на квадратные импульсы постоянного тока с магнитудой 300 мВ/мм с частотой 100 Гц для 48ч. Непрерывно перекачивать полную среду со скоростью 10 йл/ч, чтобы обеспечить адекватное питание клеток и поддерживать постоянное значение рН в среде.
6. Иммунофлуоресценция анализы MNPCs после импульсной стимуляции DC
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, все реагенты перекачивается через средний вход с помощью шприца насоса.
- После 3, 7 или 14 дней в пробирке (DIV) культивированияпосле посева 1, мыть клетки с 1x PBS со скоростью потока 25 йл/мин в течение 20 мин.
- Исправить клетки с 4% параформальдегид (PFA). Насос 4% PFA в чип со скоростью потока 25 йл/мин в течение 20 минут, чтобы заменить 1x PBS. Чтобы заменить 4% PFA, мыть клетки с 1x PBS со скоростью потока 25 йл/мин в течение 20 мин.
- Насос 0,1% Triton X-100 в чип со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 минут, чтобы проницать клетки. Уменьшите скорость потока до 50 йл/ч еще на 30 минут, чтобы вступать в реакцию с клетками. Чтобы заменить 0,1% Triton X-100, мыть клетки с 1x PBS со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 мин.
- Блокируйте клетки с ПОМОЩЬю PBS, содержащего 1% бычьего альбумин сыворотки (BSA), чтобы уменьшить неспецифические связывания антител. Насос 1% BSA в чип со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 минут. Уменьшите скорость потока до 100 йл/ч и накачав на 1 ч.
- Накачать антитела для двойного иммуностея в чип со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 минут, и инкубировать чип для 18 ч при 4 градусов по Цельсию. Вымойте клетки с 1x PBS со скоростью потока 50 йл/мин в течение 15 мин.
- Насос Alexa Fluor-конъюгированных вторичных антител в чип со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 минут. Уменьшите скорость потока до 50 йл/ч и прокачавте антитела на 1 ч при комнатной температуре в темноте. Вымойте клетки с 1x PBS со скоростью потока 50 йл/мин в течение 15 мин.
- Для ядерного окрашивания, насос Hoechst 33342 в чип со скоростью потока 20 йл/мин в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Вымойте клетки с 1x PBS со скоростью потока 50 йл/мин в течение 15 мин.
- После иммуностиммента наблюдайте за клетками с помощью конфокального флуоресцентных микроскопов.
7. Анализ изображений и обработка данных
- Анализ флуоресцентных изображений с помощью программного обеспечения со встроенными измерительными инструментами (см. таблицу материалов).
- Сравните ядра Hoechst-counterstained (общее количество клеток) в контрольных и лечебных группах и вычислите процент клеток, выражаюющих каждый фенотипический маркер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подробная конфигурация чипа МЧС показана на рисунке 1. Микрофлюидный чип обеспечивает полезный подход для уменьшения размера экспериментальной установки, объема выборки и объема реагентов. Чип MOE был разработан для проведения трех независимых экспериментов по стимуляции EF и нескольких иммуностетенгенных состояний одновременно в одном исследовании(рисунок 3). Кроме того, чип МЧС, который имеет высокую оптическую прозрачность, подходит для конфокальных микроскопий. Чип MOE также предназначен для исследования влияния различных условий клеточной культуры (например, множественная стимуляция EF, несколько препаратов, различные субстрат покрытия, несколько серий клеток) одновременно в одном эксперименте.
MNPCs подверглись воздействию импульсов квадратной волны DC (величина 300 мВ/мм с частотой 100 Гц). Стимуляция пульса ПОСТОЯННО проводилась в течение 48 ч. Дифференцированные клетки были иммунотеплиты с Tuj1 (нейрон-специфический класс III β-тубулин), глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP для выявления астроцитов), и олигодендроцитов маркер O4. После лечения пульса DC, mNPCs выразил значительно большое количество нейронов (Tuj1 "клеток) на DIV 7. На DIV 3 астроциты (клетки GFAP) присутствовали на относительно более высоких уровнях в группах стимуляции, чем в контрольной (CTL) группе. По сравнению с группой CTL, олигодендроциты (O4' клетки) были значительно выше в группе стимуляции на DIV 7 и DIV 14 (Рисунок 7). Эти результаты показывают, что стимуляция пульса DC привела к дифференциации mNPCs на нейроны, астроциты и олигодендроциты одновременно в среде обслуживания стволовых клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что микрофлюидная система МЧС подходит для долгосрочного исследования дифференциации клеток с помощью микроскопии.
Рисунок 1: Подробная конфигурация многоканального оптически прозрачного электротактического чипа. (A)Взорван вид сборки чипов МЧС. Чип MOE состоит из листов PMMA (50 мм x 25 мм x 1 мм), двухсторонней ленты (50 мм х 25 мм x 0,07 мм), адаптеров (10 мм x 10 мм x 6 мм) оптический лист PMMA (50 мм x 75 мм x 3 мм), двусторонняя лента (24 мм х 60 мм х 0,07 мм) и стекло крышки (24 мм × 60 мм). В чипе МЧС есть три камеры клеточной культуры. Чип МЧС имеет соединительные отверстия для среднего входного/выхода и агар-соляных мостов. Клетки были откоумерты в области клеточной культуры (ширина 3 мм x длина 42 мм x высота 0,07 мм). Рисунок 1A был изменен с Chang et al.6. (B)Фотография чипа MOE, включающего адаптеры, листы PMMA, двустороннюю ленту и стекло крышки. Аббревиатуры: многоканальный оптически прозрачный электротакс МЧС; ПММА и полиметилметилат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Процессы изготовления и сборки чипа МЧС. (A)Разработанные узоры листов PMMA или двусторонняя лента были изготовлены с использованием лазерного микромашина. (B)Отдельные листы PMMA были разрезаны лазерным писцом CO2. (C)Несколько слоев очищенных листов PMMA были связаны между ем тепловым связуем. Аббревиатуры: многоканальный оптически прозрачный электротакс МЧС; ПММА и полиметилметакрилат; CO2 - углекислый газ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Фотография чипа МЧС. Эта цифра была изменена с Chang et al.6. Аббревиатура: многоканальный оптически прозрачный электротакс МЧС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Среднее и электрическое подключение к чипу MOE. ( A ) Фотография компонентов для сети среднего потока и сети EF в микрофлюидной системе МЧС, включая трубку PTFE, разъем с плоским дном, конусный разъем, адаптер конуса-Люера, белый палец-жесткий штепсельная вилка, адаптер Luer, шприц замка Luer, черный резиновый bung, и ag/AgCl электроды. (B)Фотография конфигурации для сети среднего потока. Аббревиатуры: многоканальный оптически прозрачный электротакс МЧС; EF - электрическое поле; PTFE - полиэтилен политтрафторэтилен; Ag и серебро; AgCl и серебряный хлорид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Фотография, показывающая чип МЧС на микроскопе. Аббревиатуры: многоканальный оптически прозрачный электротакс МЧС; Ag и серебро; AgCl - серебряный хлорид; ИТО - индий-тин-оксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Конфигурация и система, используемая для стимуляции пульса DC. (A) Конфигурация всей системы для стимуляции пульса DC. Шприцы, подключенные к чипу МЧС, использовались для среднего вливания и отходов эффлюкса. Пульс постоянного тока в чипе обеспечивался электроприбором, проведенным через электроды Ag/AgCl. Установка устройства была установлена на моторизованной сцене X-Y-Я перевернутого фазо-контрастного микроскопа, оснащенного цифровой камерой. (B)Фотография, показывающая установку на лабораторной скамейке. Аббревиатуры: многоканальный оптически прозрачный электротакс МЧС; Ag и серебро; AgCl - серебряный хлорид; ИТО - индий-тин-оксид; EF - электрическое поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Дифференциация клеток mNPC в контрольной группе (CTL) и в группе стимуляции пульса DC на DIV 3, 7 и 14. Процент нейронов (Tuj1' клеток), астроцитов (клетки GFAP) и олигодендроцитов (O4" клетки) в (A-C) группы CTL и (D-F) в группе стимуляции (DC импульсов). Эта цифра была опубликована Чанг и др.1. Аббревиатуры: CTL: контроль; DC - прямое ток; Tuj1 - нейрон-специфический класс III β-тубулин; GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок; O4 - олигодендроцитный маркер O4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во время изготовления чипа МЧС адаптеры прикрепляются к слою 1 чипа МЧС с быстро действующим цианоакрилатом. Клей наносится на 4 угла адаптеров, а затем равномерно наносится на адаптеры. Избыточного количества клея следует избегать, чтобы обеспечить полную полимеризацию клея. Кроме того, завершенная сборка чипов МЧС инкубируется в вакуумной камере. Этот шаг помогает удалить пузырьки между слоем PMMA, двусторонняя лента, и крышка стекла.
Выбор электродного материала основан на том факте, что ионы хлорида, которые в изобилии присутствуют в среде, являются электролитическими продуктами, протекающими через область клеточной культуры. Во время эксперимента по стимуляции EF рН вокруг электродов оставался неизменным. Более простая конфигурация с использованием платины (Pt) в качестве электродного материала электролизов воды и генерирует ионы водорода(H) и ионы гидроксида (OH-) на положительном электроде и отрицательном электроде, соответственно, вызывая изменения рН в области культуры. Избегая использования pt электродов обходит проблему изменения рН во время эксперимента стимуляции EF.
Горячая агароза и агароза без пузырьков необходимы при подготовке сети соляных мостов. Горячая агароза имеет высокую текучесть и может быть легко введена в сеть соляного моста. Подключите шприц блокировки Luer к адаптеру Luer после введения 3% горячей агарозы в адаптер Luer. Во время этого шага, агароза будет толкнул вверх в шприц блокировки Luer так, что пузырь свободной твердой связи сети соляного моста может быть достигнуто. Пузыри в соляных мостах повышают электрическую устойчивость и, следовательно, ожидаемый электрический ток не может быть достигнут. После инъекции агарозы важно дождаться, пока агароза остынет и затвердеет при комнатной температуре в течение 10-20 минут, чтобы предотвратить образование затверделого агорозного мусора в области клеточной культуры.
Чип MOE помещается на обогреватель ITO, который заблокирован на программируемой моторизованной сцене X-Y-Я. Вся система построена на перевернутом фазо-контрастном микроскопе, оснащенном цифровой камерой для мониторинга дифференциации клеток в регионах клеточной культуры в чипе. Удобно наблюдать за морфологией клеток и получением автоматических изображений замедленного действия в микрофлюидной системе МЧС за пределами инкубатора. Эта микрофлюидная система не только сокращает необходимое экспериментальное время, но и повышает точность управления микроокниронией.
Клетки mNPC растут как подвеска в средствах культуры. Тем не менее, mNPCs придерживаясь PLL покрытием пластины в чипе МЧС имеют решающее значение для дифференциации. Нейросферы, образованные 30-40 клетками, предпочтительнее для инициирования дифференциации mNPC. Разрастание мНПЦ ухудшит выживаемость клеток в процессе дифференциации. Кроме того, после импульсной стимуляции DC, иммунофлуоресценция окрашивания экспериментальных может быть затронута скорость потока. Таким образом, используйте несколько потоков для различных шагов, чтобы избежать отсоединения клеток во время стирки.
В этом исследовании ограничением этого метода является то, что чип MOE не может быть повторно использован из-за трудностей в тщательной очистке чипа. Тем не менее, чип MOE может быть помещен под фазо-контрастный микроскоп или сканирующий конфокальный микроскоп напрямую. Водонепроницаемая конструкция зарегистрированной микрофлюидной системы гарантирует, что буферное/среднее испарение не происходит, сохраняя точную концентрацию буфера/среды и соответствующих электрических свойств. Снижая объемы реагентов и соответствующее время работы, микрофлюидная система МЧС обеспечивает эффективный подход к изучению клеточной дифференциации.
Предыдущее исследование показало, что EGF и bFGF способствуют выживанию, расширению и техническому обслуживанию NPC в недифференцированном состоянии4. В этом исследовании импульсы DC индуцируют дифференциацию mNPCs в среде обслуживания стволовых клеток, которая содержала EGF и bFGF. Предыдущие исследования сообщили, что EF способствует дифференциации NPC в нейроны и / или астроцитов в дифференциации среды без EGF и bFGF14,21,22. Эти результаты показывают, что MNPCs дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты после стимуляции пульса DC. Они также предполагают, что простое лечение пульса DC может контролировать судьбу NPC. С дальнейшей оптимизацией времени стимуляции, силы EF, или цикла службы, импульсы DC могут быть применены для манипулирования дифференциацией NPC и могут быть использованы для разработки терапевтических стратегий, которые используют NPC для лечения расстройств нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят профессора Тан К. Тан, Институт биомедицинских наук, Академия Sinica, за его помощь в обеспечении мыши нервных стволовых и прародителя клеток (mNPCs). Авторы также благодарят профессора Тан К. Тан и г-жу Ин-Шан Ли за их ценную дискуссию о дифференциации мНПЦ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
