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Bioengineering

カーブレット変換ベースのツールを使用したフィブリラーコラーゲンの定量化

Published: November 11, 2020
doi:
10.3791/61931
,
1Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, Center for Quantitative Cell Imaging,University of Wisconsin-Madison, 2Departments of Medical Physics and Biomedical Engineering,University of Wisconsin-Madison, 3Morgridge Institute for Research, Madison, Wisconsin, 4test,test

Summary

ここでは、正常組織と疾患組織の両方の細胞外マトリックスでフィブリラーコラーゲン組織を定量化するための曲線変換ベースのオープンソースMATLABソフトウェアツールを使用するプロトコルを提示する。このツールは、コラーゲン繊維や他の種類の線状の構造を持つ画像に適用することができます。

Abstract

フィブリラールコラーゲンは、顕著な細胞外マトリックス(ECM)成分であり、そのトポロジー変化は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌および膵臓癌を含む幅広い疾患の進行に関連していることが示されている。自由に利用できる繊維定量化ソフトウェアツールは、主に繊維の配置や向きの計算に焦点を当てており、手動ステップの要件、騒々しい背景での繊維エッジの検出の不正確さ、または局在化された特徴の欠如などの制限の対象となります。このプロトコルで説明するコラーゲン繊維定量ツールは、曲線変換(CT)によって可能になる最適なマルチスケール画像表現を使用して特徴付けられる。このアルゴリズムアプローチにより、他のツールから得られた間接的なピクセル単位またはウィンドウごとの情報を使用するのではなく、繊維から直接位置情報と向き情報を提供するために、フィブリラコラーゲン画像からのノイズの除去とファイバエッジの強化が可能になります。この CT ベースフレームワークには、”CT-FIRE” と “CurveAlign” という名前の 2 つの別個のリンクされたパッケージが含まれ、グローバル、関心領域 (ROI)、または個々のファイバ ベースでファイバー組織を定量化できます。この定量フレームワークは、10年以上にわたって開発され、現在では包括的でユーザー主導のコラーゲン定量プラットフォームへと進化してきました。このプラットフォームを使用すると、長さ、角度、幅、直線などの個々のファイバ特性、密度や位置合わせなどのバルク測定など、最大約30のファイバフィーチャを測定できます。また、手動または自動でセグメント化された境界に対して、ファイバ角度を測定することもできます。このプラットフォームには、ROI 分析、自動境界作成、後処理用のモジュールなど、いくつかの追加モジュールも用意されています。このプラットフォームを使用すると、プログラミングや画像処理の経験が必要ではなく、数百または数千の画像を含む大規模なデータセットを処理することができ、生物学的または生物学的医療用途のためのコラーゲン繊維組織の効率的な定量化を可能にします。

Introduction

フィブリラコラーゲンは顕著で、構造ECM成分である。彼らの組織は、組織機能に影響を与え、骨形成不全1、心臓機能不全2、および創傷治癒3から乳癌4、5、6、卵巣7、8、腎臓9、および膵臓癌10を含む異なるタイプの癌に至るまで、多くの疾患の進行に関連している可能性が高い。確立された多くのイメージングモダリティは、第2高調波発生顕微鏡11のようなフィブリラコラーゲンを可視化するために使用することができ、光場または蛍光顕微鏡または偏光顕微鏡12、液晶系偏光顕微鏡(LC-PolScope)13、および電子顕微鏡14と共に染色または染料。フィブリラコラーゲン組織の重要性が明らかになり、これらの方法の使用が増加し、コラーゲン繊維分析法の改善の必要性も高まっています。

フィブリルコラーゲンの自動測定のための計算方法の開発には多くの取り組みが行われてきました。自由に利用可能なソフトウェアツールは、主に、画像タイル17のピクセル15、16、またはフーリエ変換ベースのスペクトル解析に対して第1微分または構造テンソルのいずれかを採用することにより、繊維の配向または向きの計算に焦点を当てる。これらのツールはすべて、手動ステップの要件、雑多な背景でのファイバー エッジの検出の不正確さ、またはローカライズされた特徴の特徴付けの欠如などの制限の対象となります。

このプロトコルで説明する他の自由なオープンソースフリーソフトウェアツールと比較して、このプロトコルで説明されている方法では、CT(最適なマルチスケール、指向性画像表現法)を使用して、フィブリラのコラーゲン画像からノイズを除去し、ファイバーエッジを強化または追跡します。位置と方向に関する情報は、ピクセル単位またはウィンドウごとの間接的な情報を使用してファイバー編成のメトリックを推測するのではなく、ファイバーから直接提供できます。このCTベースのフレームワーク18、19、20、21は、主に2つの別々のリンクされた「CT-FIRE」18、21と「CurveAlign」19、21という名前のパッケージを介して、グローバル、ROI、またはファイバベースでファイバー組織を定量化することができます。ソフトウェアの実装に関する限り、CT-FIREでは、複数のスケールのCT係数を使用して、エッジを強化し、ノイズを低減する画像を再構築することができます。次に、CT再構成画像に個別の繊維抽出アルゴリズムを適用して、代表的な中心点を見つけ、中心点から繊維枝を伸ばし、繊維枝をリンクしてファイバーネットワークを形成するためのファイバーを追跡します。CurveAlign では、ユーザ指定のスケールの CT 係数を使用してローカルの繊維配向を追跡し、カーブレットの方向と位置を抽出してグループ化し、対応する位置で繊維の配向を推定します。この結果として生じる定量化フレームワークは、10年以上にわたって開発され、機能、ユーザーインターフェイス、モジュール性など、多くの面で大きく進化してきました。たとえば、このツールは、ローカルの繊維配向を視覚化し、長さ、角度、幅、直線などの個々の繊維特性を含む最大 30 のファイバー フィーチャ、密度や位置合わせなどのバルク測定を測定できます。さらに、ユーザは手動または自動でセグメント化された境界に対して繊維角度を測定することができ、これは、例えば、乳癌22および膵臓癌研究10における画像ベースのバイオマーカーの発達において重要な役割を果たす。このプラットフォームは、ROI分析、自動境界作成、後処理用の機能モジュールを含む、いくつかの機能モジュールを提供します。ROIモジュールはROIのさまざまな形状にアノータを付け、対応するROI分析を行うために使用できます。アプリケーションの例として、自動境界作成モジュールを使用して、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の明るいフィールド画像を第2高調波生成(SHG)画像で登録し、登録されたH&E画像から腫瘍境界の画像マスクを生成することができます。後処理モジュールは、個々の画像からの出力データファイルの処理と統合を容易にして、可能な統計分析を行うことができます。

この定量化プラットフォームは、プログラミングや画像処理の経験を必要とせず、数百または数千の画像を含む大規模なデータセットを処理することができ、生物学的または生物医学的用途のためのコラーゲン組織の効率的な定量化を可能にします。私たちも含め、世界中の多くの研究者によって、さまざまな研究分野で広く利用されています。CT-FIREとCurveAlign18、19、20、21に関する4つの主要な出版物があり、そのうち最初の3つは272回引用されています(Google Scholarによると2020-05-04)。このプラットフォーム(CT-FIREまたはCurveAlign)を引用した出版物のレビューは、約35の出版物が私たちのグループと共同で、他の(〜75)が他のグループによって書かれた分析のために直接使用した約110のジャーナルペーパーがあることを示しています。たとえば、 このプラットフォームは、次の研究のために使用されました: 乳癌22,23,24, 膵臓癌10,25, 腎臓癌9,26, 創傷治癒3,27,28,29,30,卵巣癌8,31,7, 子宮蓋靭帯32,低リンゲン歯腺33, 基底 細胞癌34、低酸素肉腫35、軟骨組織36、心臓機能障害37、ニューロン38、神経膠芽腫39、リンパ収縮40、線維性カッコ軟骨41、胃癌42、微小管43、膀胱線維症44とが挙げられる。図1は、SHG画像から乳癌19の腫瘍関連コラーゲンシグネチャを見つけるためにCurveAlignの癌イメージングアプリケーションを示す。図 2は、このプラットフォームの一般的な概略ワークフローを示しています。これらのツールは技術的には18、19、21、および CurveAlign によるアラインメント分析のための通常のプロトコル20も利用できますが、すべての重要な機能を示すビジュアル プロトコルが役立つ可能性があります。ここで示すように、視覚化されたプロトコルは、このプラットフォームを使用する学習プロセスを容易にし、ユーザーが抱える可能性のある懸念事項や疑問に対してより効率的に対処します。

Protocol

注: このプロトコルは、コラーゲン定量のための CT-FIRE と CurveAlign の使用について説明します。これら 2 つのツールは、補完的な、しかし異なる主な目標を持ち、ある程度一緒にリンクされています。CT-FIREは、高度な後処理およびROI分析を除くほとんどの操作を行うためにCurveAlignインタフェースから起動することができます。CT-FIREのフル動作のためには、別途起動する必要があります。 …

Representative Results

これらの方法は、多くの研究で正常に適用されています。.いくつかの典型的な用途は、例えば: 1) Conklinら22 腫瘍関連コラーゲンシグネチャを計算するためにCurveAlignを使用し、コラーゲン線維がより頻繁に、その下で管癌(DCIS)病変において管周囲に垂直に整列することを発見した。2) Drifkaら10 は、CurveAlign の CT-FIRE モードを使用して膵管腺癌および正常/慢?…

Discussion

このプロトコルは、繊維状コラーゲン定量のためのCT-FIREとCurveAlignの使用を記述し、コラーゲン繊維またはCT-FIREまたはCurveAlignによる分析に適した他の線状または繊維状の細長い構造を有する任意の画像に適用することができる。例えば、エラスチンや弾性繊維は、このプラットフォーム上で同様の方法で処理することができます。我々は、計算生成合成繊維21に関する両方?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ロブ・ノワク博士を含め、長年にわたりCT-FIREとCurveAlignに多くの貢献者とユーザーに感謝します。 キャロリン・ペールケ博士、ジェレミー・ブレドフェルト博士、グニート・メータ博士、アンドリュー・ライヒト博士、マット・コンクリン博士、ジェイン・リスル博士、パオロ・プロヴェンツァーノ博士、ブレンダ・オグル博士、パトリシア・キーリー博士、ジョセフ・スズルシェフスキ博士、スザンヌ・パウニク博士この研究は、半導体研究公社、モルグリッジ研究所、NIHがK.W.EにR01CA199996、R01CA181385、U54CA210190を助成金として提供しました。

Materials

CT-FIRE Univerity of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign University of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/
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Keywords: Fibrillar CollagenCollagen OrganizationExtracellular MatrixCurvelet TransformCT-FIREImage AnalysisFiber ExtractionRegion Of InterestPost-processing
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Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools. J. Vis. Exp. (165), e61931, doi:10.3791/61931 (2020).
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