곡선 변환 기반 도구를 사용하여 피브릴라 콜라겐 조직을 정량화
Summary
여기서는 정상 및 병이 있는 조직의 세포외 매트릭스에서 세브릴라 콜라겐 조직을 정량화하기 위한 커브릿 변환 기반 오픈 소스 MATLAB 소프트웨어 도구를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 도구는 콜라겐 섬유 또는 다른 유형의 라인 과 같은 구조를 가진 이미지에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
피브릴라 콜라겐은 눈에 띄는 세포 외 매트릭스 (ECM) 구성 요소이며, 그들의 토폴로지 변화는 유방, 난소, 신장 및 췌장암을 포함한 광범위한 질병의 진행과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 자유롭게 사용할 수 있는 섬유 정량화 소프트웨어 도구는 주로 섬유 정렬 또는 방향계산에 중점을 두고 있으며, 수동 단계의 요구 사항, 시끄러운 배경에서 섬유 에지 감지의 부정확성 또는 국소화 된 기능 특성화의 부족과 같은 제한 사항이 적용됩니다. 이 프로토콜에 설명된 콜라겐 섬유 수량 도구는 커브릿 변환(CT)에 의해 활성화된 최적의 다중 스케일 이미지 표현을 사용하는 것이 특징입니다. 이러한 알고리즘 접근 방식을 통해 피브릴라 콜라겐 이미지에서 노이즈를 제거하고 섬유 가장자리가 향상되어 다른 도구에서 얻은 간접 픽셀 또는 창 별 정보를 사용하는 대신 섬유에서 직접 위치 및 방향 정보를 제공할 수 있습니다. 이 CT 기반 프레임워크에는 글로벌, 관심 영역(ROI) 또는 개별 섬유 기준으로 섬유 조직을 정량화할 수 있는 “CT-FIRE” 및 “CurveAlign”이라는 두 개의 별도 패키지가 포함되어 있습니다. 이 정량화 프레임워크는 10년 이상 개발되었으며 이제 포괄적인 사용자 중심의 콜라겐 정량화 플랫폼으로 발전했습니다. 이 플랫폼을 사용하면 길이, 각도, 너비 및 직선과 같은 개별 섬유 특성과 밀도 및 정렬과 같은 벌크 측정을 포함하여 최대 30개의 섬유 기능을 측정할 수 있습니다. 또한 사용자는 수동으로 또는 자동으로 분할된 경계를 기준으로 광섬유 각도를 측정할 수 있습니다. 또한 이 플랫폼은 ROI 분석, 자동 경계 생성 및 후처리를 위한 모듈을 포함한 몇 가지 추가 모듈을 제공합니다. 이 플랫폼을 사용하면 프로그래밍 또는 이미지 처리에 대한 사전 경험이 필요하지 않으며 수백 또는 수천 개의 이미지를 포함한 대규모 데이터 집합을 처리할 수 있으므로 생물학적 또는 생체 의학 응용 을 위한 콜라겐 섬유 조직의 효율적인 정량화를 가능하게 합니다.
Introduction
피브릴라 콜라겐은 눈에 띄는 구조ECM 구성 요소입니다. 이들의 조직 변화는 조직 기능에 영향을 미치고 골발생불완전성 1,심장 기능 장애2,상처 치유3에서 유방4,5,6,난소7,8,신장9,췌장암10을포함한 다양한 유형의 암에 이르는 많은 질병의 진행과 연관될 가능성이 있다. 많은 확립된 이미징 양식은 제2 고조파 생성 현미경검사법(11),밝은 필드 또는 형광 현미경 또는 편광 광 현미경 검사법과 함께 피브릴라 콜라겐을 시각화하는 데 사용할 수 있으며, 액정 계 편광 현미경 검사법(LC-PolScope) 13, 전자 현미경검사법14. 피브릴라 콜라겐 조직의 중요성이 명확해지고 이러한 방법의 사용이 증가함에 따라 콜라겐 섬유 분석 접근 방식의 개선필요성도 커지고 있습니다.
피브릴라 콜라겐의 자동화된 측정을 위한 계산 방법을 개발하기 위한 많은 노력이 있었습니다. 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 도구는 주로 이미지타일(17)에대한 제1유도체 또는 구조 텐서 또는 포리에 변환 기반 스펙트럼 분석을 채택하여 섬유 정렬 또는 방향의 계산에 초점을 맞추고 있다. 이러한 모든 도구는 수동 단계의 요구 사항, 시끄러운 배경에서 섬유 모서리 감지의 부정확성 또는 지역화 된 기능 특성화의 부족과 같은 제한사항이 적용됩니다.
자유롭게 사용할 수 있는 다른 오픈 소스 무료 소프트웨어 도구와 비교하여 이 프로토콜에 설명된 메서드는 최적의 다중 규모의 방향성 이미지 표현 방법인 CT를 사용하여 피브릴라 콜라겐 이미지에서 노이즈를 제거하고 섬유 가장자리를 향상시키거나 추적합니다. 위치 및 방향에 대한 정보는 간접 픽셀 또는 창 별 정보를 사용하여 섬유 조직의 메트릭을 추론하는 것이 아니라 섬유에서 직접 제공될 수 있습니다. 이 CT 기반프레임워크(18,19,20,21)는 주로 두 개의 분리된 것을 통해 글로벌, ROI 또는 섬유 기초에 섬유 조직을 정량화할 수 있지만, “CT-FIRE”18,21 및“CurveAlign”19,21이라는이름의 패키지가 있습니다. 소프트웨어 구현과 관련하여 CT-FIRE에서 여러 스케일의 CT 계수를 사용하여 가장자리를 향상시키고 노이즈를 줄이는 이미지를 재구성할 수 있습니다. 그런 다음, 개별 섬유 추출 알고리즘이 CT 재구성 된 이미지에 적용되어 대표 중심 점을 찾고, 중앙 점에서 섬유 분기를 확장하고, 섬유 가지를 연결하여 섬유 네트워크를 형성하기 위한 섬유를 추적합니다. CurveAlign에서 사용자 지정 규모의 CT 계수를 사용하여 곡선의 방향과 위치를 추출하고 그룹화하여 해당 위치에서 섬유 방향을 추정하는 로컬 섬유 방향을 추적할 수 있습니다. 이러한 결과 정량화 프레임워크는 10년 이상 개발되었으며 기능, 사용자 인터페이스 및 모듈성 과 같은 여러 측면에서 크게 발전해 왔습니다. 예를 들어, 이 도구는 로컬 섬유 방향을 시각화할 수 있으며 길이, 각도, 너비 및 직선성과 같은 개별 섬유 특성과 밀도 및 정렬과 같은 벌크 측정을 포함하여 최대 30개의 섬유 기능을 측정할 수 있습니다. 또한, 사용자는 수동으로 또는 자동으로 분할된 경계에 비해 섬유각을 측정할 수 있으며, 이는 예를 들어유방암(22)과 췌장암연구(10)에서이미지 기반 바이오마커 개발에 중요한 역할을 한다. 이 플랫폼은 ROI 분석, 자동 경계 생성 및 후처리를 위한 기능을 포함한 여러 기능 모듈을 제공합니다. ROI 모듈은 다양한 형태의 ROI에 알리고 해당 ROI 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 응용 사례로서, 자동 경계 생성 모듈은 제2 고조파 생성(SHG) 이미지를 가진 헤마톡시린 및 에오신(H&E) 밝은 필드 영상을 등록하고 등록된 H&E 심상으로부터 종양 경계의 이미지 마스크를 생성하는 데 사용될 수 있다. 후처리 모듈은 가능한 통계 분석을 위해 개별 이미지에서 출력 데이터 파일을 처리하고 통합하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 정량화 플랫폼은 프로그래밍 또는 이미지 처리에 대한 사전 경험이 필요하지 않으며 수백 또는 수천 개의 이미지를 포함한 대규모 데이터 집합을 처리할 수 있으므로 생물학적 또는 생체 의학 응용 프로그램을 위한 콜라겐 조직의 효율적인 정량화를 가능하게 합니다. 그것은 널리 전 세계 많은 연구자에 의해 다른 연구 분야에서 사용 되었습니다., 자신을 포함 하 여. CT-FIRE 및 CurveAlign18,19,20,21에4 개의 주요 간행물이 있으며, 그 중 처음 세 개는 272 번 인용되었습니다 (Google 학자에 따르면 2020-05-04 현재). 이 플랫폼 (CT-FIRE 또는 CurveAlign)을 인용 한 출판물의 검토는 약 35 개의 출판물이 우리 그룹과 협력하고 다른 그룹 (~ 75)이 다른 그룹에 의해 작성된 분석을 위해 직접 사용하는 약 110 개의 저널 논문이 있음을 나타냅니다. 예를 들어, 이 플랫폼은 유방암22,23,24,췌장암10,25,신장암9,26,상처치유3,27,28,29,30,난소암8,31,7,자궁 대장대인32,저혈당 상종33,기저세포암(34) 저산소육종(35) , 연골조직36,심장기능장애37개,뉴런38,교모세포종39,림프수축40,섬유성 카펠드41,위암42,미세투벌레43,및 광섬유증44. 도 1은 SHG 이미지로부터 유방암19의 종양 관련 콜라겐 시그니처를 찾기 위해 CurveAlign의 암 이미징 응용을 입증한다. 그림 2는 이 플랫폼의 일반적인 회로도 워크플로우를 설명합니다. 이러한 도구는 기술적으로18,19,21을 검토하고 CurveAlign과의 정렬 분석을 위한 정규프로토콜(20)도 사용할 수 있지만 모든 필수 기능을 보여주는 시각적 프로토콜도 유용할 수 있습니다. 여기에 제시된 바와 같이 시각화된 프로토콜은 이 플랫폼을 사용하는 학습 프로세스를 용이하게 할 뿐만 아니라 사용자가 가질 수 있는 우려 사항과 질문을 보다 효율적으로 해결할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 피브릴라 콜라겐 정량화를 위해 CT-FIRE 및 CurveAlign의 사용을 설명하고 콜라겐 섬유 또는 CT-FIRE 또는 CurveAlign에 의해 분석에 적합한 다른 라인 과 같은 또는 섬유와 같은 길쭉한 구조를 가진 모든 이미지에 적용 될 수 있습니다. 예를 들어 엘라스틴 또는 탄성 섬유는 이 플랫폼에서 유사한 방식으로 처리될 수 있습니다. 우리는 계산 생성 합성 섬유(21)에두 도구를 모?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 닥터 롭 노박을 포함하여 수년에 걸쳐 CT-FIRE 및 CurveAlign에 많은 기여자와 사용자에게 감사드립니다, 캐롤린 펠케 박사, 제레미 브레드펠트 박사, 구네트 메타, 앤드류 라이히트 박사, 아디브 케이호스라비 박사, 맷 콘클린 박사, 제인 다람쥐, 파올로 프로방스자노 박사, 브렌다 오글 박사, 패트리샤 킬리 박사, 조셉 셀체프스키 박사, 스앤 스니크 박사 이 작품은 반도체 연구 회사, 모드리지 연구소, NIH보조금 R01CA199996, R01CA181385 및 U54CA210190을 K.W.E에 지원했습니다.
Materials
| CT-FIRE | Univerity of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/ |
| CurveAlign | University of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/ |
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