Kvantifisere fibrillar kollagenorganisasjon med kurve transformerebaserte verktøy

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å bruke et kurveglassede, åpen kildekode MATLAB-programvareverktøy for å kvantifisere fibrillar kollagenorganisasjon i den ekstracellulære matrisen av både normalt og sykt vev. Dette verktøyet kan brukes på bilder med kollagenfibre eller andre typer linjelignende strukturer.

Abstract

Fibrillar kollagen er fremtredende ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, og deres topologi endringer har vist seg å være forbundet med utviklingen av et bredt spekter av sykdommer, inkludert bryst, eggstokkene, nyre, og bukspyttkjertelkreft. Fritt tilgjengelige fiber kvantifisering programvareverktøy er hovedsakelig fokusert på beregning av fiber justering eller orientering, og de er underlagt begrensninger som kravet om manuelle trinn, unøyaktighet i påvisning av fiber kanten i støyende bakgrunn, eller mangel på lokalisert funksjon karakterisering. Kollagen fiber kvantisering verktøyet beskrevet i denne protokollen er preget av å bruke en optimal multiskala bilde representasjon aktivert av kurve transformering (CT). Denne algoritmiske tilnærmingen gjør det mulig å fjerne støy fra fibrillar kollagenbilder og forbedring av fiberkanter for å gi steds- og orienteringsinformasjon direkte fra en fiber, i stedet for å bruke den indirekte pikselvise eller vindusvise informasjonen hentet fra andre verktøy. Dette CT-baserte rammeverket inneholder to separate, men koblede pakker kalt “CT-FIRE” og “CurveAlign” som kan kvantifisere fiberorganisasjon på en global interesseregion (ROI) eller individuell fiberbasis. Dette kvantifiseringsrammeverket er utviklet i mer enn ti år og har nå utviklet seg til en omfattende og brukerdrevet kollagenkvantifiseringsplattform. Ved hjelp av denne plattformen kan man måle opptil tretti fiberfunksjoner, inkludert individuelle fiberegenskaper som lengde, vinkel, bredde og retthet, samt bulkmålinger som tetthet og justering. I tillegg kan brukeren måle fibervinkel i forhold til manuelt eller automatisk segmenterte grenser. Denne plattformen tilbyr også flere ekstra moduler, inkludert de for ROI-analyse, automatisk grenseoppretting og etterbehandling. Bruk av denne plattformen krever ikke tidligere erfaring med programmering eller bildebehandling, og den kan håndtere store datasett, inkludert hundrevis eller tusenvis av bilder, noe som muliggjør effektiv kvantifisering av kollagenfiberorganisasjon for biologiske eller biomedisinske applikasjoner.

Introduction

Fibrillar kollagen er fremtredende, strukturelle ECM-komponenter. Deres organisasjon endrer innvirkning vev funksjon og er sannsynlig forbundet med utviklingen av mange sykdommer som spenner fra osteogenese imperfecta^1,hjerte^{dysfunksjon 2,}og sårheling³ til ulike typer kreft inkludert bryst^4,5,6,ovarian^7,8, nyre⁹, og bukspyttkjertelkreft¹⁰. Mange etablerte bildemodaliteter kan brukes til å visualisere fibrillar kollagen som andre harmonisk generasjon mikroskopi^11,flekker eller fargestoffer i forbindelse med lyse felt eller fluorescensmikroskopi eller polarisert lysmikroskopi^12,flytende krystallbasert polariseringmikroskopi (LC-PolScope)¹³og elektronmikroskopi¹⁴. Etter hvert som betydningen av fibrillar kollagenorganisasjon har blitt klarere, og bruken av disse metodene har økt, har behovet for forbedret kollagenfiberanalyse også vokst.

Det har vært mange anstrengelser for å utvikle beregningsmetoder for automatisert måling av fibrillar kollagen. Fritt tilgjengelige programvareverktøy er hovedsakelig fokusert på beregning av fiberjustering eller orientering ved å vedta enten første derivat eller struktur tensor for piksler^15,16eller Fourier transform-basert spektrumanalyse for bildefliser¹⁷. Alle disse verktøyene er underlagt begrensninger som kravet om manuelle trinn, unøyaktighet i påvisning av fiberkanten i støyende bakgrunn, eller mangel på lokalisert funksjonskarakterisering.

Sammenlignet med andre fritt tilgjengelige åpen kildekode-gratis programvareverktøy, bruker metodene som er beskrevet i denne protokollen CT – en optimal, multiskala, retningsbestemt bilderepresentasjonsmetode – for å fjerne støy fra fibrillarlagenbilder og forbedre eller spore fiberkanter. Informasjon om plassering og orientering kan gis direkte fra en fiber i stedet for ved å bruke den indirekte pikselvise eller vindusvise informasjonen til å utlede beregningene til fiberorganisasjonen. Dette CT-baserte^{rammeverket 18,19,20,21} kan kvantifisere fiberorganisasjon på global, avkastning eller fiberbasis, hovedsakelig via to separate, men koblede pakker kalt “CT-FIRE”^18,21 og “CurveAlign”^19,21. Når det gjelder implementeringen av programvaren, kan CT-FIRE-koeffisienter på flere skalaer brukes til å rekonstruere et bilde som forbedrer kantene og reduserer støy. Deretter brukes en individuell fiberekstraksjonsalgoritme på det CT-rekonstruerte bildet for å spore fibre for å finne sine representative senterpunkter, utvide fibergrener fra midtpunktene og knytte fibergrener for å danne et fibernettverk. I CurveAlign kan CT-koeffisienter på en brukerspesifisert skala brukes til å spore lokal fiberorientering, der retningen og plasseringen av kurveletter ekstraheres og grupperes for å estimere fiberorienteringen på de tilsvarende stedene. Dette resulterende kvantifiseringsrammeverket er utviklet i mer enn ti år og har utviklet seg sterkt i mange aspekter som funksjonalitet, brukergrensesnitt og modularitet. For eksempel kan dette verktøyet visualisere lokal fiberorientering og lar brukeren måle opptil tretti fiberfunksjoner, inkludert individuelle fiberegenskaper som lengde, vinkel, bredde og retthet, samt bulkmålinger som tetthet og justering. I tillegg kan brukeren måle fibervinkel i forhold til manuelt eller automatisk segmenterte grenser, som for eksempel spiller en viktig rolle i bildebasert biomarkørutvikling i brystkreft²² og kreftstudier^{i bukspyttkjertelen 10}. Denne plattformen inneholder flere funksjonsmoduler, inkludert de for roi-analyse, automatisk grenseoppretting og etterbehandling. ROI-modulen kan brukes til å kommentere ulike former for avkastning og utføre tilsvarende avkastningsanalyse. Som et eksempel på søknad kan den automatiske grenseopprettingsmodulen brukes til å registrere hematoksylin og eosin (H&E) lyse feltbilder med andre harmoniske generasjonsbilder (SHG) og generere bildemasken av tumorgrenser fra de registrerte H&E-bildene. Etterbehandlingsmodulen kan bidra til å lette behandling og integrering av utdatafiler fra individuelle bilder for mulig statistisk analyse.

Denne kvantifiseringsplattformen krever ikke tidligere erfaring med programmering eller bildebehandling og kan håndtere store datasett, inkludert hundrevis eller tusenvis av bilder, noe som muliggjør effektiv kvantifisering av kollagenorganisasjon for biologiske eller biomedisinske applikasjoner. Det har vært mye brukt i ulike forskningsfelt av mange forskere over hele verden, inkludert oss selv. Det er fire hovedpublikasjoner på CT-FIRE og CurveAlign^18,19,20,21, hvorav de tre første har blitt sitert 272 ganger (per 2020-05-04 ifølge Google Scholar). En gjennomgang av publikasjonene som siterte denne plattformen (CT-FIRE eller CurveAlign) indikerer at det er omtrent 110 tidsskriftpapirer som direkte brukte den til deres analyse, der ca 35 publikasjoner samarbeidet med gruppen vår, og de andre (~ 75) ble skrevet av andre grupper. For eksempel, denne plattformen ble brukt til følgende studier: brystkreft^22,23,24, kreft i^{bukspyttkjertelen 10,25}, nyrekreft^9,26, sårheling^{3,27,28,29,30}, eggstokkreft^8,31,7, uterosacral ligament³², hypofosfatmisk dentin³³, basalcellekarsinom³⁴, hypoksisk sarkom³⁵, bruskvev³⁶, hjertedysfunksjon³⁷, nevroner³⁸, glioblastom³⁹, lymfatiske sammentrekninger⁴⁰, fibrøse kaktos⁴¹, magekreft⁴², mikrotubuli⁴³og blærefibrose⁴⁴. Figur 1 demonstrerer kreftavbildningsapplikasjonen av CurveAlign for å finne de tumorrelaterte kollagensignaturene^{til brystkreft 19} fra SHG-bildet. Figur 2 beskriver en typisk skjematisk arbeidsflyt for denne plattformen. Selv om disse verktøyene har blitt gjennomgått teknisk^18,19,21,og en vanlig^{protokoll 20} for justering analyse med CurveAlign er også tilgjengelig, en visuell protokoll som demonstrerer alle de essensielle funksjonene kan være nyttig. En visualisert protokoll, som presentert her, vil lette læringsprosessen ved å bruke denne plattformen, samt mer effektivt ta opp bekymringer og spørsmål som brukerne kan ha.

Protocol

MERK: Denne protokollen beskriver bruken av CT-FIRE og CurveAlign for kollagenkvantifisering. Disse to verktøyene har komplementære, men forskjellige, hovedmål og er knyttet sammen til en viss grad. CT-FIRE kan startes fra CurveAlign-grensesnittet for å utføre de fleste operasjoner, bortsett fra avansert etterbehandling og avkastningsanalyse. For full drift av CT-FIRE, bør den lanseres separat. 1. Krav til bildesamling og bilde MERK: Verktøyet kan behandle en h…

Representative Results

Disse metodene har blitt brukt i mange studier. Noen typiske applikasjoner inkluderer: 1) Conklin et al.22 brukte CurveAlign til å beregne tumor-assosiert kollagen signaturer, og fant at kollagen fibre var oftere justert vinkelrett på kanalen omkretsen i ductal karsinom in situ (DCIS) lesjoner; 2) Drifka et al.10 brukte CT-FIRE-modus i CurveAlign å kvantifisere stromal kollagen justering for bukspyttkjertel ductal adenokarsinom og normal / kronisk pankreatitt vev, og fan…

Discussion

Denne protokollen beskriver bruken av CT-FIRE og CurveAlign for fibrillar kollagen kvantifisering og kan brukes på et bilde med kollagenfibre eller andre linjelignende eller fiberlignende langstrakte strukturer egnet for analyse av CT-FIRE eller CurveAlign. For eksempel kan elastin eller elastiske fibre behandles på en lignende måte på denne plattformen. Vi har testet begge verktøyene på beregningsmessig genererte syntetiske fibre²¹. Avhengig av programmet bør brukerne velge analysemodusen …

Materials

CT-FIRE	Univerity of Wisconsin-Madison	N/A	open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign	University of Wisconsin-Madison	N/A	open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/