JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

تحريض وتحليل الإجهاد التأكسدي في الجمال النائم Transposon-Transfected الخلايا الظهارية صبغة الشبكية البشرية

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/61957
, , , , ,
1Experimental Ophthalmology,University of Geneva, 2Department of Ophthalmology,University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

نقدم بروتوكول لتطوير واستخدام نموذج الإجهاد التأكسدي عن طريق علاج الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية مع H2O2، وتحليل مورفولوجيا الخلايا ، وقابلية البقاء ، والكثافة ، الجلوتاثيون ، ومستوى UCP-2. وهو نموذج مفيد للتحقيق في التأثير المضاد للأكسدة من البروتينات التي تفرزها الخلايا المتحولة جنسيا لعلاج الانحطاط العصبي الشبكي.

Abstract

يلعب الإجهاد التأكسدي دورا حاسما في العديد من الأمراض التنكسية ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض يصيب حوالي 30 مليون مريض في جميع أنحاء العالم. وهو يؤدي إلى انخفاض في ظهارة صبغ الشبكية (RPE) توليفها العوامل العصبية، على سبيل المثال، عامل مشتق من ظهارة الصباغ (PEDF) وعامل تحفيز مستعمرة الحبيبية الضامة (GM-CSF)، تليها فقدان خلايا RPE، وفي نهاية المطاف مستقبلات ضوئية وخلية العقدة الشبكية (RGC) الموت. نحن نفترض أن إعادة تشكيل بيئة الشبكية العصبية والعصبية من خلال زرع تحت الشبكية لخلايا RPE المصابة التي تفرط في التعبير عن PEDF و GM-CSF لديه القدرة على منع انحطاط الشبكية من خلال التخفيف من آثار الإجهاد التأكسدي ، وتثبيط الالتهاب ، ودعم بقاء الخلية. باستخدام نظام الإرسال والاستقبال الجمال النائم (SB100X)وقد تم تحويل خلايا RPE الإنسان مع الجينات PEDF وجنرال موتورز-CSF وأظهرت التكامل الجيني مستقرة، والتعبير الجيني على المدى الطويل، وإفراز البروتين باستخدام qPCR، وصمة عار الغربية، ELISA، و immunofluorescence. لتأكيد وظائف وفعالية PEDF و GM-CSF التي تفرزها خلايا RPE المصابة ، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لتحديد الحد من الإجهاد التأكسدي H2O2– الناجم عن خلايا RPE في الثقافة. تم تقييم حماية الخلايا من خلال تحليل مورفولوجيا الخلايا والكثافة ومستوى الجلوتاثيون داخل الخلايا والتعبير الجيني UCP2 وقابلية بقاء الخلية. وأظهر كل من خلايا RPE المصابة التي تزيد من التعبير عن PEDF و / أو GM-CSF والخلايا غير المصابة ولكن المعالجة مع PEDF و / أو GM-CSF (المتاحة تجاريا أو النقية من الخلايا المصابة) حماية كبيرة للخلايا المضادة للأكسدة مقارنة بالضوابط غير المعالجة. النموذج الحالي H2O2هو نهج بسيط وفعال لتقييم التأثير المضاد للأكسدة للعوامل التي قد تكون فعالة لعلاج AMD أو الأمراض العصبية المماثلة.

Introduction

النموذج الموصوف هنا، يقدم نهجا مفيدا لتقييم كفاءة العوامل الصيدلانية الحيوية للحد من الإجهاد التأكسدي في الخلايا. لقد استخدمنا النموذج للتحقيق في الآثار الوقائية ل PEDF و GM-CSF على الإجهاد التأكسدي H2O2– بوساطة على الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية ، والتي تتعرض لمستويات عالية من O2، والضوء المرئي ، وداء البلعومية لأغشية الجزء الخارجي مستقبلات ضوئية ، مما يولد مستويات كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)1، 2. وهي تعتبر مساهما رئيسيا في الإمراض من الضمور البقعي المرتبط بالعمر الوعائي (aAMD)3،4،5،6،7،8. الى جانب ذلك ، هناك انخفاض في العوامل العصبية المركبة RPE ، وتحديدا عامل الصباغ المشتقة من الظهارة (PEDF) ، وعوامل النمو الشبيهة بالإنسولين (IGFs) ، وعامل تحفيز مستعمرة الماكروفولسيتي الحبيبي (GM-CSF) مما يؤدي إلى خلل وفقدان خلايا RPE ، تليها خلية الشبكية والشبكية العقدية (RGC) وفاة3و4و5 . AMD هو مرض معقد ينتج عن التفاعل بين العوامل الأيضية والوظيفية والوراثية والبيئية4. عدم وجود علاجات لAMD هو السبب الرئيسي للعمى في المرضى الذين تزيد أعمارهم عن 60 سنة في البلدان الصناعية9،10. إعادة تشكيل بيئة الشبكية العصبية والعصبية المنشأ عن طريق زرع تحت الشبكية من خلايا RPE المعدلة وراثيا الإفراط في التعبير PEDF وجنرال موتورز-CSF لديه القدرة على منع انحطاط الشبكية عن طريق التخفيف من آثار الإجهاد التأكسدي, تثبيط التهاب ودعم بقاء الخلية11,12,13,14,15,16 . على الرغم من أن هناك العديد من المنهجيات لتسليم الجينات إلى الخلايا، اخترنا غير الفيروسية فرط النشاط الجمال النائم transposon نظام لتسليم PEDF والجنرال موتورز-CSF الجينات إلى خلايا RPE بسبب ملفها الشخصي السلامة، ودمج الجينات في جينوم الخلايا المضيفة، وميلها لدمج الجينات تسليمها في مواقع نشطة غير النسخ كما أظهرنا سابقا17، 18،19.

يمكن أن يسبب الإجهاد التأكسدي الخلوي في الخلايا المستزرعة في المختبر من قبل العديد من العوامل التأكسدية، بما في ذلك بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)،4-هيدروينونال (HNE)، tertbutylhydroperoxide (tBH)، وارتفاع التوترات الأكسجين، والضوء المرئي (الطيف الكامل أو الأشعة فوق البنفسجية)20،21. تتطلب التوترات العالية للأوكسجين والضوء معدات وظروف خاصة، مما يحد من إمكانية النقل إلى أنظمة أخرى. عوامل مثل H2O2، HNE ، و tBH تحفز تداخل الإجهاد التأكسدي التغيرات الجزيئية والخلوية. اخترنا H2O2 لاختبار النشاط المضاد للأكسدة من PEDF و GM-CSF لأنه مناسب وذي صلة بيولوجيا لأنه يتم إنتاجه من قبل خلايا RPE كأوكسجين تفاعلي وسيط أثناء مستقبلات ضوئية الجزء الخارجي phagocytosis22 ويوجد في الأنسجة العينية في الجسم الحي23. منذ أكسدة الجلوتاثيون قد تكون مسؤولة جزئيا عن إنتاج H2O2 في العين، قمنا بتحليل مستويات GSH / الجلوتاثيون في دراساتنا، والتي ترتبط H2O2-الناجم عن الإجهاد التأكسدي والقدرة التجديدية للخلايا21،22. تحليل مستويات الجلوتاثيون ذات صلة خاصة لأنه يشارك في آليات الحماية المضادة للأكسدة في العين24. يستخدم التعرض ل H2O2 بشكل متكرر كنموذج لفحص قابلية الإجهاد التأكسدي والنشاط المضاد للأكسدة لخلايا RPE1و25و26و27و28و29و30، بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يظهر أوجه تشابه مع تلف الإجهاد التأكسدي الناجم عن الضوء ، وهو مصدر “فسيولوجي” للإجهاد التأكسدي21.

لتقييم وظائف وفعالية العوامل العصبية، قمنا بتطوير نموذج في المختبر يسمح للتحليل بتحديد التأثير المضاد للأكسدة لعوامل النمو التي تعبر عنها الخلايا المعدلة وراثيا للتعبير المفرط عن PEDF و GM-CSF. هنا، نظهر أن خلايا RPE المصابة بجينات PEDF و GM-CSF أكثر مقاومة للآثار الضارة ل H2O2 من خلايا التحكم غير المصابة، كما يتضح من مورفولوجيا الخلية، والكثافة، والبقاء، ومستوى داخل الخلايا من الجلوتاثيون، والتعبير عن الجين UCP2، الذي رموز للبروتين الميتوكوندريا فك 2 التي ثبت للحد من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)31.

Protocol

وقد وافقت اللجنة الأخلاقية للبحوث الكانتونية (رقم 2016-01726) على إجراءات جمع العين البشرية واستخدامها. 1. عزل الخلية وظروف الثقافة خط الخلية ARPE-19 البشري الثقافة 5 × 105 خلايا ARPE-19، خط الخلية RPE الإنسان، في دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة / المغذيات خليط F-12 لحم الخنزي?…

Representative Results

تحريض الإجهاد التأكسدي في الخلايا الظهارية صبغ الشبكية البشريةتم التعامل مع ARPE-19 وخلايا hRPE الأولية بتركيزات متفاوتة من H2O2 لمدة 24 ساعة وتم قياس مستوى الجلوتاثيون المضاد للأكسدة داخل الخلايا كميا(الشكل 2A،B). H2O2 ?…

Discussion

يقدم البروتوكول المعروض هنا نهجا لتحليل وظيفة مكافحة الأكسدة والحماية ل PEDF و GM-CSF التي تنتجها الخلايا المصابة ، والتي يمكن تطبيقها على الخلايا المصابة بأي جين مفيد مفترض. في الاستراتيجيات العلاجية الجينية التي تهدف إلى إيصال البروتينات إلى الأنسجة عن طريق زرع الخلايا المعدلة وراثيا، من ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود المؤلفان أن يشكرا غريغ سيلي وألان كونتي على المساعدة التقنية الممتازة والبروفيسور زوزسانا إزفاك من مركز ماكس دلبروك في برلين على التكرم بتوفير PSB100X و pT2-CAGGS-فينوس بلاميدز. وقد دعم هذا العمل كل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم والمفوضية الأوروبية في سياق البرنامج الإطاري السابع. تم تمويل Z.I من قبل مجلس البحوث الأوروبي، ERC المتقدمة [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD – From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. . National Institute of Health Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -. D., Su, M. -. Y., Chen, T. -. T., Hong, H. -. Y., Han, A. -. D., Li, W. -. S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 – induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

Oxidative StressHydrogen PeroxideSleeping Beauty TransposonHuman Retinal Pigment Epithelial CellsAge-related Macular DegenerationNeurodegenerative DiseasesARPE-19 Cell LinePEDFGM-CSFNickel NTAProtein PurificationBCA Protein AssayConditioned MediumHydrogen Peroxide Treatment
check_url/61957?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image