JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/61957
, , , , ,
1Experimental Ophthalmology,University of Geneva, 2Department of Ophthalmology,University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

We presenteren een protocol voor de ontwikkeling en het gebruik van een oxidatieve stress-model door retinale pigmentepitheelcellen te behandelen met H2O2, waarbij celmorfologie, levensvatbaarheid, dichtheid, glutathion en UCP-2-niveau worden geanalyseerd. Het is een nuttig model om het antioxiderende effect te onderzoeken van eiwitten die worden uitgescheiden door getransfecteerde cellen om neuroretinale degeneratie te behandelen.

Abstract

Oxidatieve stress speelt een cruciale rol bij verschillende degeneratieve ziekten, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een pathologie die wereldwijd ~ 30 miljoen patiënten treft. Het leidt tot een afname van retinale pigmentepitheel (RPE) – gesynthetiseerde neuroprotectieve factoren, bijvoorbeeld pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), gevolgd door het verlies van RPE-cellen, en uiteindelijk fotoreceptor en retinale ganglioncel (RGC) dood. We veronderstellen dat de reconstitutie van de neuroprotectieve en neurogene retinale omgeving door de subretinale transplantatie van getransfecteerde RPE-cellen die PEDF en GM-CSF overexpresseren, het potentieel heeft om retinale degeneratie te voorkomen door de effecten van oxidatieve stress te verminderen, ontsteking te remmen en celoverleving te ondersteunen. Met behulp van het Doornroosje transposonsysteem(SB100X)zijn menselijke RPE-cellen getransfecteerd met de PEDF- en GM-CSF-genen en hebben ze stabiele genintegratie, genexpressie op lange termijn en eiwitsecretie aangetoond met behulp van qPCR, western blot, ELISA en immunofluorescentie. Om de functionaliteit en de potentie van de PEDF en GM-CSF uitgescheiden door de getransfecteerde RPE-cellen te bevestigen, hebben we een in vitro assay ontwikkeld om de reductie van H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress op RPE-cellen in cultuur te kwantificeren. Celbescherming werd geëvalueerd door celmorfologie, dichtheid, intracellulair niveau van glutathion, UCP2-genexpressie en levensvatbaarheid van cellen te analyseren. Zowel getransfecteerde RPE-cellen die PEDF en/of GM-CSF overexpressie geven als cellen die niet-getransfecteerd zijn maar voorbehandeld met PEDF en/of GM-CSF (in de handel verkrijgbaar of gezuiverd uit getransfecteerde cellen) vertoonden een significante antioxidant celbescherming in vergelijking met niet-behandelde controles. Het huidige H2O2-model is een eenvoudige en effectieve benadering om het antioxiderende effect te evalueren van factoren die effectief kunnen zijn om AMD of vergelijkbare neurodegeneratieve ziekten te behandelen.

Introduction

Het hier beschreven model biedt een nuttige benadering om de efficiëntie van biofarmaceutische middelen te evalueren voor het verminderen van oxidatieve stress in cellen. We hebben het model gebruikt om de beschermende effecten van PEDF en GM-CSF op de H2O2-gemedieerde oxidatieve stress op retinale pigmentepitheelcellen te onderzoeken, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van O2en zichtbaar licht, en de fagocytose van fotoreceptor buitenste segmentmembranen, die aanzienlijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren1, 2. Ze worden beschouwd als een belangrijke bijdrage aan de pathogenese van avasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (aAMD)3,4,5,6,7,8. Bovendien is er een afname van RPE-gesynthetiseerde neuroprotectieve factoren, met name de pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF), insuline-achtige groeifactoren (IGF’s) en granulocyt macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) die leidt tot de disfunctie en het verlies van RPE-cellen, gevolgd door fotoreceptor en retinale ganglioncel (RGC) dood3,4,5 . AMD is een complexe ziekte die het gevolg is van de interactie tussen metabole, functionele, genetische en omgevingsfactoren4. Het gebrek aan behandelingen voor aAMD is de belangrijkste oorzaak van blindheid bij patiënten ouder dan 60 jaar in geïndustrialiseerde landen9,10. De reconstitutie van de neuroprotectieve en neurogene retinale omgeving door de subretinale transplantatie van genetisch gemodificeerde RPE-cellen die PEDF en GM-CSF overexpressie geven, heeft het potentieel om retinale degeneratie te voorkomen door de effecten van oxidatieve stress te verminderen, ontstekingen te remmen en celoverleving te ondersteunen11,12,13,14,15,16 . Hoewel er verschillende methodologieën zijn om genen aan cellen te leveren, hebben we gekozen voor het niet-virale hyperactieve Doornroosje transposonsysteem om de PEDF- en GM-CSF-genen aan RPE-cellen te leveren vanwege het veiligheidsprofiel, de integratie van de genen in het genoom van de gastheercellen en de neiging om de afgeleverde genen te integreren in niet-transcriptioneel actieve sites zoals we eerder hebben aangetoond17, 18,19.

Cellulaire oxidatieve stress kan worden geïnduceerd in cellen die in vitro zijn gekweekt door verschillende oxidatieve middelen, waaronder waterstofperoxide (H2O2),4-hydroynonenaal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), hoge zuurstofspanningen en zichtbaar licht (volledig spectrum of UV-straling)20,21. Hoge zuurstofspanningen en licht vereisen speciale apparatuur en omstandigheden, die de overdraagbaarheid naar andere systemen beperken. Middelen zoals H 2 O2,HNE en tBH induceren overlappende oxidatieve stress moleculaire en cellulaire veranderingen. We kozen H2O2 om de antioxiderende activiteit van PEDF en GM-CSF te testen omdat het handig en biologisch relevant is omdat het wordt geproduceerd door RPE-cellen als een reactief zuurstoftussenproduct tijdens fotoreceptor buitenste segment fagocytose22 en het wordt gevonden in oculaire weefsels in vivo23. Aangezien de oxidatie van glutathion gedeeltelijk verantwoordelijk kan zijn voor de productie van H2O2 in het oog, hebben we de niveaus van GSH / glutathion in onze studies geanalyseerd, die verband houden met H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress en het regeneratieve vermogen van cellen21,22. De analyse van glutathionspiegels is vooral relevant omdat het deelneemt aan de anti-oxidatieve beschermingsmechanismen in het oog24. Blootstelling aan H2O2 wordt vaak gebruikt als een model om de oxidatieve stressgevoeligheid en antioxiderende activiteit van RPE-cellen1,25,26,27,28,29,30te onderzoeken en bovendien vertoont het overeenkomsten met door licht geïnduceerde oxidatieve stressschade, een “fysiologische” bron van oxidatieve stress21.

Om de functionaliteit en de effectiviteit van neuroprotectieve factoren te evalueren, hebben we een in vitro model ontwikkeld dat de analyse mogelijk maakt om het anti-oxidatieve effect van groeifactoren uitgedrukt door cellen die genetisch gemodificeerd zijn om PEDF en GM-CSF te overexpressie te kwantificeren. Hier laten we zien dat RPE-cellen getransfecteerd met de genen voor PEDF en GM-CSF beter bestand zijn tegen de schadelijke effecten van H2O2 dan niet-getransfecteerde controlecellen, zoals blijkt uit celmorfologie, dichtheid, levensvatbaarheid, intracellulair niveau van glutathion en expressie van het UCP2-gen, dat codeert voor het mitochondriale ontkoppelingseiwit 2 waarvan is aangetoond dat het reactieve zuurstofsoorten (ROS) vermindert31.

Protocol

Procedures voor het verzamelen en gebruiken van menselijke ogen werden goedgekeurd door de Kantonnale Ethische Commissie voor Onderzoek (nr. 2016-01726). 1. Celisolatie en kweekomstandigheden Menselijke ARPE-19 cellijn Kweek 5 x 105 ARPE-19 cellen, een menselijke RPE-cellijn, in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham’s F-12) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 80 U/ml penicilline, 80 μg/ml streptomycine en 2,5 μg/ml amfote…

Representative Results

Inductie van oxidatieve stress in menselijke retinale pigmentepitheelcellenARPE-19 en primaire hRPE-cellen werden behandeld met verschillende concentraties van H2O2 gedurende 24 uur en het intracellulaire niveau van de antioxidant glutathion werd gekwantificeerd (Figuur 2A,B). H2O2 bij 50 μM en 100 μM had geen invloed op de glutathionproductie, terwijl er bij 350 μM een signi…

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol biedt een benadering om de anti-oxidatieve en beschermende functie van PEDF en GM-CSF geproduceerd door getransfecteerde cellen te analyseren, die kunnen worden toegepast op cellen die zijn getransfecteerd met elk vermeend gunstig gen. In gentherapeutische strategieën die tot doel hebben eiwitten aan weefsel te leveren door genetisch gemodificeerde cellen te transplanteren, is het van cruciaal belang om informatie te verkrijgen over het niveau van eiwitexpressie, de levensduur van expres…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Gregg Sealy en Alain Conti bedanken voor hun uitstekende technische assistentie en Prof. Zsuzsanna Izsvák van het Max-Delbrück Center in Berlijn voor het leveren van de pSB100X en pT2-CAGGS-Venus plasmiden. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Sciences Foundation en de Europese Commissie in het kader van het zevende kaderprogramma. Z.I werd gefinancierd door european research council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD – From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. . National Institute of Health Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -. D., Su, M. -. Y., Chen, T. -. T., Hong, H. -. Y., Han, A. -. D., Li, W. -. S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 – induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

Oxidative StressHydrogen PeroxideSleeping Beauty TransposonHuman Retinal Pigment Epithelial CellsAge-related Macular DegenerationNeurodegenerative DiseasesARPE-19 Cell LinePEDFGM-CSFNickel NTAProtein PurificationBCA Protein AssayConditioned MediumHydrogen Peroxide Treatment
check_url/61957?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image