Induction et analyse du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes transfectées par transposon de la belle endormie
Summary
Nous présentons un protocole pour le développement et l’utilisation d’un modèle de stress oxydatif en traitant les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes avec H2O2, en analysant la morphologie cellulaire, la viabilité, la densité, le glutathion et le niveau UCP-2. C’est un modèle utile pour étudier l’effet antioxydant des protéines sécrétées par les cellules transfectées par transposon pour traiter la dégénérescence neurorétinienne.
Abstract
Le stress oxydatif joue un rôle essentiel dans plusieurs maladies dégénératives, y compris la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une pathologie qui touche environ 30 millions de patients dans le monde. Il entraîne une diminution des facteurs neuroprotecteurs synthétisés par l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), par exemple le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), suivis de la perte de cellules RPE et éventuellement de la mort des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Nous émettons l’hypothèse que la reconstitution de l’environnement rétinien neuroprotecteur et neurogène par la transplantation sous-rétinienne de cellules EPR transfectées surexprimant le PEDF et le GM-CSF a le potentiel de prévenir la dégénérescence rétinienne en atténuant les effets du stress oxydatif, en inhibant l’inflammation et en soutenant la survie cellulaire. En utilisant le système de transposon de la Belle au bois dormant (SB100X),les cellules RPE humaines ont été transfectées avec les gènes PEDF et GM-CSF et ont montré une intégration génétique stable, une expression génique à long terme et une sécrétion de protéines à l’aide de la qPCR, du transfert western, de l’ELISA et de l’immunofluorescence. Pour confirmer la fonctionnalité et la puissance du PEDF et du GM-CSF sécrétés par les cellules RPE transfectées, nous avons développé un test in vitro pour quantifier la réduction du stress oxydatif induit parH2O2sur les cellules RPE en culture. La protection cellulaire a été évaluée en analysant la morphologie cellulaire, la densité, le niveau intracellulaire de glutathion, l’expression du gène UCP2 et la viabilité cellulaire. Les cellules EPR transfectées surexprimant le PEDF et/ou le GM-CSF et les cellules non transfectées mais prétraitées avec du PEDF et/ou du GM-CSF (disponibles dans le commerce ou purifiées à partir de cellules transfectées) ont montré une protection cellulaire antioxydante significative par rapport aux témoins non traités. Le présent modèleH2O2est une approche simple et efficace pour évaluer l’effet antioxydant de facteurs qui peuvent être efficaces pour traiter la DMLA ou des maladies neurodégénératives similaires.
Introduction
Le modèle décrit ici offre une approche utile pour évaluer l’efficacité des agents biopharmaceutiques pour réduire le stress oxydatif dans les cellules. Nous avons utilisé le modèle pour étudier les effets protecteurs du PEDF et du GM-CSF sur le stress oxydatif médié parH2O2sur les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes, qui sont exposées à des niveaux élevés d’O2et de lumière visible, et la phagocytose des membranes du segment externe des photorécepteurs, générant des niveaux significatifs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)1, 2. Ils sont considérés comme un contributeur majeur à la pathogenèse de la dégénérescence maculaire avasculaire liée à l’âge (AMMA)3,4,5,6,7,8. En outre, il y a une diminution des facteurs neuroprotecteurs synthétisés par l’EPR, en particulier le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF), les facteurs de croissance analogues à l’insuline (IGF) et le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF) conduisant au dysfonctionnement et à la perte de cellules RPE, suivis de la mort des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC)3,4,5 . La DMLA est une maladie complexe qui résulte de l’interaction entre des facteurs métaboliques, fonctionnels, génétiques et environnementaux4. Le manque de traitements pour la MAA est la principale cause de cécité chez les patients âgés de plus de 60 ans dans les pays industrialisés9,10. La reconstitution de l’environnement rétinien neuroprotecteur et neurogène par la transplantation sous-rétinienne de cellules RPE génétiquement modifiées surexprimant le PEDF et le GM-CSF a le potentiel de prévenir la dégénérescence rétinienne en atténuant les effets du stress oxydatif, en inhibant l’inflammation et en soutenant la survie cellulaire11,12,13,14,15,16 . Même s’il existe plusieurs méthodologies pour délivrer des gènes aux cellules, nous avons choisi le système de transposon hyperactif non viral de la Belle au bois dormant pour délivrer les gènes PEDF et GM-CSF aux cellules RPE en raison de son profil de sécurité, de l’intégration des gènes dans le génome des cellules hôtes et de sa propension à intégrer les gènes délivrés dans des sites non transcriptionnellement actifs comme nous l’avons montré précédemment17, 18,19.
Le stress oxydatif cellulaire peut être induit dans les cellules cultivées in vitro par plusieurs agents oxydatifs, dont le peroxyde d’hydrogène(H2O2),le 4-hydroynonenal (HNE), le tertbutylhydroperoxyde (tBH), les tensions élevées en oxygène et la lumière visible (spectre complet ou irradiation UV)20,21. Les tensions élevées d’oxygène et la lumière nécessitent un équipement et des conditions spéciales, ce qui limite la transférabilité à d’autres systèmes. Des agents tels queH2O2,HNE et tBH induisent des changements moléculaires et cellulaires de stress oxydatif qui se chevauchent. Nous avons choisi H2O2 pour tester l’activité antioxydante du PEDF et du GM-CSF parce qu’il est pratique et biologiquement pertinent puisqu’il est produit par les cellules RPE comme intermédiaire réactif de l’oxygène lors de la phagocytose du segment externe des photorécepteurs22 et qu’il se trouve dans les tissus oculaires in vivo23. Étant donné que l’oxydation du glutathion peut être partiellement responsable de la production deH2O2dans l’œil, nous avons analysé les niveaux de GSH / glutathion dans nos études, qui sont liés au stress oxydatif induit par H2O2et à la capacité de régénération des cellules21,22. L’analyse des niveaux de glutathion est particulièrement pertinente car elle participe aux mécanismes de protection anti-oxydatifs dans l’œil24. L’exposition àH2O2 est fréquemment utilisée comme modèle pour examiner la susceptibilité au stress oxydatif et l’activité antioxydante des cellules RPE1,25,26,27,28,29,30, et, en outre, elle montre des similitudes avec les dommages causés par le stress oxydatif induit par la lumière, une source « physiologique » de stress oxydatif21.
Pour évaluer la fonctionnalité et l’efficacité des facteurs neuroprotecteurs, nous avons développé un modèle in vitro qui permet à l’analyse de quantifier l’effet antioxydant des facteurs de croissance exprimés par les cellules génétiquement modifiées pour surexprimer le PEDF et le GM-CSF. Ici, nous montrons que les cellules RPE transfectées avec les gènes du PEDF et du GM-CSF sont plus résistantes aux effets nocifs deH2O2 que ne le sont les cellules témoins non transfectées, comme en témoignent la morphologie cellulaire, la densité, la viabilité, le niveau intracellulaire de glutathion et l’expression du gène UCP2, qui code pour la protéine de découplage mitochondrial 2 dont il a été démontré qu’elle réduit les espèces réactives de l’oxygène (ROS)31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici offre une approche pour analyser la fonction antioxydante et protectrice du PEDF et du GM-CSF produits par les cellules transfectées, qui peuvent être appliquées aux cellules transfectées avec n’importe quel gène bénéfique putatif. Dans les stratégies thérapeutiques géniques qui ont pour objectif de délivrer des protéines aux tissus en transplantant des cellules génétiquement modifiées, il est essentiel d’obtenir des informations sur le niveau d’expression des protéines, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Gregg Sealy et Alain Conti pour l’excellente assistance technique et le professeur Zsuzsanna Izsvák du Centre Max-Delbrück à Berlin pour avoir aimablement fourni les plasmides pSB100X et pT2-CAGGS-Venus. Ces travaux ont été soutenus par le Fonds national suisse de la recherche scientifique et la Commission européenne dans le cadre du septième programme-cadre. Z.I a été financé par le Conseil européen de la recherche, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].
Materials
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 6-well plates | Greiner | 7657160 | |
| 96-well culture plate white with clear flat bottom | Costar | 3610 | Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay) |
| 96-well plates | Corning | 353072 | |
| Acrylamid 40% | Biorad | 161-0144 | |
| Amphotericin B | AMIMED | 4-05F00-H | |
| Antibody anti-GMCSF | ThermoFisher Scientific | PA5-24184 | |
| Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM | Agilent | P0260 | |
| Antibody anti-PEDF | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-390172 | |
| Antibody anti-penta-His | Qiagen | 34660 | |
| Antibody anti-phospho-Akt | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP | Abcam | ab6721 | |
| Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Antibody goat anti-mouse Alexa 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | |
| ARPE-19 cell line | ATCC | CRL-2302 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
| chamber culture glass slides | Corning | 354118 | |
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Duo Set ELISA kit | R&D Systems | DY215-05 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 78440 | |
| ELISAquant kit | BioProducts MD | PED613-10-Human | |
| Eyes (human) | Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN) | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism software (version 8.0) | GraphPad Software, Inc. | ||
| GSH-Glo Glutathione Assay | Promega | V6912 | |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Merck | 107209 | |
| ImageJ software (image processing program) | W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014 | ||
| Imidazol | Axonlab | A1378.0010 | |
| Leica DMI4000B microscope | Leica Microsystems | ||
| LightCycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | ||
| LightCycler 480 SW1.5.1 software | Roche Molecular Systems | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
| NaH2PO4 | Axonlab | 3468.1000 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30410 | |
| Nitrocellulose | VWR | 732-3197 | |
| Omega Lum G Gel Imaging System | Aplegen Life Science | ||
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Primers | Invitrogen | See Table 1 in Supplementary Materials | |
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796. | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796. | ||
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51304 | |
| recombinant hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
| recombinant hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
| ReliaPrep RNA Cell Miniprep System | Promega | Z6011 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
| RNase-free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74204 | |
| SDS | Applichem | A2572 | |
| Semi-dry transfer system for WB | Bio-Rad | ||
| SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | ThermoFisher Scientific | 15504020 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Tween | AppliChem | A1390 | |
| Urea | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| WesternBright ECL HRP substrate | Advansta | K-12045-D50 | |
| Whatman nitrocellulose membrane | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |
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