JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Induktion og analyse af oxidativ stress i tornerose Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelceller

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/61957
, , , , ,
1Experimental Ophthalmology,University of Geneva, 2Department of Ophthalmology,University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Vi præsenterer en protokol for udvikling og brug afan oxidativ stress-model ved at behandle retinale pigment epitelceller med H2O2, analysere celle morfologi, levedygtighed, tæthed, glutathion, og UCP-2 niveau. Det er en nyttig model til at undersøge antioxidanteffekten af proteiner udskilt af transposon-transfected celler til behandling af neuroretinal degeneration.

Abstract

Oxidativ stress spiller en afgørende rolle i flere degenerative sygdomme, herunder aldersrelateret makuladegeneration (AMD), en patologi, der påvirker ~ 30 millioner patienter på verdensplan. Det fører til et fald i retinal pigment epitel (RPE)-syntetiseret neuroprotektive faktorer, f.eks pigment epitel-afledt faktor (PEDF) og granulocyte-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), efterfulgt af tabet af RPE celler, og i sidste ende fotoreceptor og retinal ganglion celle (RGC) død. Vi hypotese, at rekonstitution af neuroprotektive og neurogene retinale miljø ved subretinal transplantation af transfected RPE celler overekspressere PEDF og GM-CSF har potentiale til at forhindre retinal degeneration ved at afbøde virkningerne af oxidativ stress, hæmme inflammation, og støtte celle overlevelse. Ved hjælp af Tornerose transposon system (SB100X)menneskelige RPE celler er blevet transfected med PEDF og GM-CSF gener og vist stabil genintegration, langsigtet genekspression, og protein sekretion ved hjælp af qPCR, vestlige blot, ELISA, og immunofluorescence. For at bekræfte funktionaliteten og styrken af PEDF og GM-CSF udskilles af de transfected RPE celler, har vi udviklet en in vitro assay til at kvantificere reduktionen af H2O2-induceretoxidativ stress på RPE celler i kultur. Cellebeskyttelse blev evalueret ved at analysere cellemorfologi, tæthed, intracellulært niveau af glutathion, UCP2 genekspression og celle levedygtighed. Begge transfected RPE-celler, der overekspresserer PEDF og/eller GM-CSF, og celler, der ikke er transfected, men forbehandlet med PEDF og/eller GM-CSF (kommercielt tilgængelige eller renset fra transficerede celler), viste signifikant antioxidantcellebeskyttelse sammenlignet med ikke-behandlede kontroller. Den nuværende H2O2-modeler en enkel og effektiv tilgang til at evaluere antioxidanteffekten af faktorer, der kan være effektive til behandling af AMD eller lignende neurodegenerative sygdomme.

Introduction

Modellen beskrevet her, tilbyder en nyttig tilgang til at evaluere effektiviteten afbiofarmaceutiske midler til at reducere oxidativ stress i celler. Vi har brugt modellen til at undersøge de beskyttende virkninger af PEDF og GM-CSF på H2O2-medieret oxidativ stress på retinale pigment epitelceller, som udsættes for høje niveauer af O2, og synligt lys, og fagocytose af fotoreceptor ydre segment membraner, genererer betydelige niveauer af reaktive iltarter (ROS)1, 2. De betragtes som en væsentlig bidragyder til patogenesen af avaskulær aldersrelateret makuladegeneration (aAMD)3,4,5,6,7,8. Desuden er der et fald i RPE-syntetiserede neuroprotektive faktorer, specielt pigment epitel-afledt faktor (PEDF), insulin-lignende vækstfaktorer (IGFs), og granulocyte makrofag-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), der fører til dysfunktion og tab af RPE celler, efterfulgt af fotoreceptor og retinal ganglion celle (RGC) død3,4,5 . AMD er en kompleks sygdom, der skyldes samspillet mellem metaboliske, funktionelle, genetiske og miljømæssige faktorer4. Manglen på behandlinger for aAMD er den vigtigste årsag til blindhed hos patienter over 60 år i de industrialiserede lande9,10. Rekonstitutionen af det neuroprotektive og neurogene retinale miljø ved subretinal transplantation af genetisk modificerede RPE-celler, der overekspresserer PEDF og GM-CSF, har potentiale til at forhindre retinal degeneration ved at afbøde virkningerne af oxidativ stress, hæmme inflammation og understøtte celleoverlevelse11,12,13,14,15,16 . Selvom der er flere metoder til at levere gener til celler, har vi valgt det ikke-virale hyperaktive Tornerose transposon-system til at levere PEDF- og GM-CSF-generne til RPE-celler på grund af dets sikkerhedsprofil, integrationen af generne i værtscellernes genom og dets tilbøjelighed til at integrere de leverede gener i ikke-transskriptionsaktive steder, som vi tidligere har vist17, 18,19.

Cellulær oxidativ stress kan induceres i celler, der dyrkes in vitro af flere oxidative agenser, herunder hydrogenperoxid (H2O2), 4-hydroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxid (tBH), høje iltspændinger og synligt lys (fuldspektret eller UV-bestråling)20,21. Høje iltspændinger og lys kræver særligt udstyr og forhold, hvilket begrænser overførselsevnen til andre systemer. Stoffer som H2O2,HNE og tBH fremkalder overlappende oxidative stress molekylære og cellulære ændringer. Vi valgte H2O2 til at teste antioxidant aktivitet PEDF og GM-CSF, fordi det er praktisk og biologisk relevant, da det er produceret af RPE celler som en reaktiv ilt mellemliggende under fotoreceptor ydre segment fagocytose22 og det findes i okulære væv in vivo23. Da oxidation af glutathion kan være delvist ansvarlig for produktionen af H2O2 i øjet, har vi analyseret niveauet af GSH / glutathion i vores undersøgelser, som er knyttet til H2O2-induceret oxidativ stress og den regenerative kapacitet af cellerne21,22. Analysen af glutathion niveauer er særligt relevant, da det deltager i de anti-oxidative beskyttelsesmekanismer i øjet24. Eksponering for H2O2 bruges ofte som model til at undersøge RPE-cellernes oxidative stressmodalitet og antioxidantaktivitet1,25,26,27,28,29,30, og derudover viser den ligheder med lysinduceret oxidativ stressskade, en “fysiologisk” kilde til oxidativ stress21.

For at evaluere funktionaliteten og effektiviteten af neuroprotektive faktorer har vi udviklet en in vitro-model, der gør det muligt for analysen at kvantificere den antioxidative effekt af vækstfaktorer udtrykt af celler, der er genetisk modificeret til at overekspressere PEDF og GM-CSF. Her viser vi, at RPE-celler transfected med generne for PEDF og GM-CSF er mere resistente over for de skadelige virkninger af H2O2 end ikke-transfected kontrolceller, som det fremgår af cellemorfologi, tæthed, levedygtighed, intracellulær niveau af glutathion og ekspression af UCP2-genet, som koder for mitokondrie upcouplingprotein 2, der har vist sig at reducere reaktive iltarter (ROS)31.

Protocol

Procedurerne for indsamling og brug af menneskelige øjne blev godkendt af Den Kantonale Etiske Forskningskommission (nr. 2016-01726). 1. Celleisolation og kulturforhold Human ARPE-19 cellelinje Kultur 5 x 105 ARPE-19 celler, en menneskelig RPE-cellelinje i Dulbeccos Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham’s F-12) suppleret med 10% fosterkvægserum (FBS), 80 U/mL penicillin, 80 μg/mL streptomycin og 2,5 μg/mL amphotericin B (komplet medium) ve…

Representative Results

Induktion af oxidativ stress i human Retinal Pigment EpitelcellerARPE-19 og primære hRPE-celler blev behandlet med varierende koncentrationer på H2O2 i 24 timer, og antioxidantglutalsens intracellulære niveau blev kvantificeret (figur 2A,B). H2O2 ved 50 μM og 100 μM påvirkede ikke produktionen af glutathion, mens der ved 350 μM var et betydeligt fald i glutathion i ARPE-1…

Discussion

Protokollen præsenteres her tilbyder en tilgang til at analysere anti-oxidative og beskyttende funktion af PEDF og GM-CSF produceret af transfected celler, som kan anvendes til celler transfected med enhver putative gavnlige gen. I genterapistrategier, der har til formål at levere proteiner til væv ved at transplantere genetisk modificerede celler, er det afgørende at indhente oplysninger om niveauet af proteinudtryk, udtryks levetiden og effektiviteten af det udtrykte protein i en model af sygdommen. I vores laborat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Gregg Sealy og Alain Conti for fremragende teknisk bistand og Prof. Zsuzsanna Izsvák fra Max-Delbrück Center i Berlin for venligt at give pSB100X og pT2-CAGGS-Venus plasmid. Dette arbejde blev støttet af Swiss National Sciences Foundation og Europa-Kommissionen inden for rammerne af det syvende rammeprogram. Z.I blev finansieret af Det Europæiske Forskningsråd, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD – From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. . National Institute of Health Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -. D., Su, M. -. Y., Chen, T. -. T., Hong, H. -. Y., Han, A. -. D., Li, W. -. S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 – induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

Oxidative StressHydrogen PeroxideSleeping Beauty TransposonHuman Retinal Pigment Epithelial CellsAge-related Macular DegenerationNeurodegenerative DiseasesARPE-19 Cell LinePEDFGM-CSFNickel NTAProtein PurificationBCA Protein AssayConditioned MediumHydrogen Peroxide Treatment
check_url/61957?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image