Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie
Summary
Die experimentellen Verfahren zur Durchführung einer diethylpyrocarbonat-basierten kovalenten Markierung mit massenspektrometrischem Nachweis werden beschrieben. Diethylpyrocarbonat wird einfach mit dem interessierenden Protein oder Proteinkomplex gemischt, was zur Modifikation von lösungsmittelzugänglichen Aminosäureresten führt. Die modifizierten Rückstände können nach proteolytischem Aufschluss und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie identifiziert werden.
Abstract
Die Charakterisierung der Struktur höherer Ordnung eines Proteins ist für das Verständnis seiner Funktion unerlässlich. Die Massenspektrometrie (MS) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für diesen Zweck entwickelt, insbesondere für Proteinsysteme, die mit herkömmlichen Methoden schwer zu untersuchen sind. Um die Struktur eines Proteins durch MS zu untersuchen, werden spezifische chemische Reaktionen in Lösung durchgeführt, die die Strukturinformationen eines Proteins in seine Masse kodieren. Ein besonders effektiver Ansatz ist die Verwendung von Reagenzien, die lösungsmittelzugängliche Aminosäure-Seitenketten kovalent modifizieren. Diese Reaktionen führen zu Massenzuwächsen, die in Kombination mit proteolytischem Aufschluss und Tandem-Massenspektrometrie mit Rückstandsauflösung lokalisiert werden können. Hier beschreiben wir die Protokolle, die mit der Verwendung von Diethylpyrocarbonat (DEPC) als kovalentes Markierungsreagenz zusammen mit dem MS-Nachweis verbunden sind. DEPC ist ein hochelektrophiles Molekül, das in der Lage ist, bis zu 30% der Rückstände im durchschnittlichen Protein zu kennzeichnen und dadurch eine hervorragende strukturelle Auflösung zu bieten. DEPC wurde erfolgreich zusammen mit MS eingesetzt, um Strukturelle Informationen für kleine Single-Domain-Proteine wie β2-Mikroglobulin bis hin zu großen Multi-Domain-Proteinen wie monoklonalen Antikörpern zu erhalten.
Introduction
Proteine sind essentielle Biomoleküle in praktisch jedem physiologischen Prozess. Die Vielfalt der Funktionen, die Proteine erfüllen, ist aufgrund der Strukturen, die sie annehmen, und der Wechselwirkungen, die sie mit anderen Biomolekülen haben, möglich. Um die Proteinfunktion auf einer tieferen Ebene zu verstehen, werden biochemische und biophysikalische Werkzeuge benötigt, um diese wichtigen strukturellen Merkmale und Wechselwirkungen aufzuklären. Traditionell haben Röntgenkristallographie, kryogene Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) die gewünschten Details auf atomarer Ebene geliefert, um die Proteinstruktur aufzudecken. Zahlreiche Proteinsysteme können jedoch aufgrund eines schlechten Kristallisationsverhaltens, einer begrenzten Proteinverfügbarkeit, einer übermäßigen Probenheterogenität oder molekularer Gewichtsbeschränkungen nicht mit diesen Techniken abgefragt werden. Folglich sind neuere Analysemethoden entstanden, die diese Einschränkungen überwinden. Zu den aufkommenden Techniken, die Proteinstrukturinformationen liefern können, gehört die Massenspektrometrie.
Die Massenspektrometrie (MS) misst das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/ z) eines Moleküls, so dass Proteinstrukturinformationen höherer Ordnung erhalten werden müssen, indem die gewünschte Strukturinformation in die Masse des Proteins kodiert wird. Es wurden mehrere Ansätze zur Kodierung dieser Informationen entwickelt, darunter Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX)1,2,3,4, chemische Vernetzung (XL)5,6und kovalente Markierung (CL)7,8,9,10. In HDX werden Backbone-Amid-Wasserstoffe durch etwas massivere Deuteriume mit Raten ausgetauscht, die von der Lösungsmittelzugänglichkeit und dem H-Bindungsumfang abhängen. Das Ausmaß von HDX kann lokalisiert werden, indem das Protein schnell in Peptidfragmente verdaut wird, bevor diese Fragmente durch das Massenspektrometer getrennt und gemessen werden oder indem das Protein in einem Top-Down-Experiment dissoziiert wird. Die Bestimmung der Austauschrate liefert weitere Einblicke in die Proteindynamik. HDX hat sich trotz der Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Rückaustausch und der Notwendigkeit spezieller Geräte zur Maximierung der Reproduzierbarkeit als wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung der Proteinstruktur erwiesen. Bei XL-MS werden Proteine mit bifunktionellen Reagenzien umgesetzt, die kovalent benachbarte Rückstandsseitenketten innerhalb eines gegebenen Proteins oder zwischen zwei Proteinen verbinden. Auf diese Weise kann XL-MS Entfernungsbeschränkungen bereitstellen, die zur Charakterisierung der Proteinstruktur verwendet werden können. Die Regionen des Proteins, die vernetzt sind, können durch proteolytische Verdauung identifiziert werden, gefolgt von einer Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS-Analyse. Während XL-MS ein vielseitiges Werkzeug ist, das zur Untersuchung einer Vielzahl von Proteinkomplexen, einschließlich innerer Zellen, verwendet wurde, ist die Identifizierung der XL-Produkte eine Herausforderung und erfordert spezielle Software.
CL-MS hat sich in letzter Zeit als komplementäres und manchmal alternatives MS-basiertes Werkzeug zur Untersuchung der Proteinstruktur und -interaktionen herausgestellt. Bei CL-MS wird ein Protein oder Proteinkomplex kovalent mit einem monofunktionellen Reagenz modifiziert, das mit lösungsmittelexponierten Seitenketten reagieren kann (Abbildung 1). Durch den Vergleich der Modifikationsausdehnungen eines Proteins oder Proteinkomplexes unter verschiedenen Bedingungen können Konformationsänderungen, Bindungsstellen und Protein-Protein-Grenzflächen aufgedeckt werden. Nach der CL-Reaktion können ortsspezifische Informationen, oft auf der Ebene einzelner Aminosäuren, mit typischen Bottom-up-Proteomik-Workflows gewonnen werden, bei denen Proteine proteolytisch verdaut, Peptidfragmente durch LC getrennt und modifizierte Stellen mit Tandem-MS (MS / MS) identifiziert werden. Die reiche Geschichte der Biokonjugatchemie hat zahlreiche Reagenzien für CL-MS-Experimente zur Verfügung gestellt. CL-Reagenzien lassen sich in zwei allgemeine Kategorien einteilen: (i) spezifisch und (ii) unspezifisch. Spezifische Reagenzien reagieren mit einer einzigen funktionellen Gruppe (z. B. freieAmine) 8,10 und sind einfach zu implementieren, liefern jedoch tendenziell nur begrenzte strukturelle Informationen. Unspezifische Reagenzien reagieren mit einer Vielzahl von Seitenketten, erfordern aber oft spezielle Geräte wie Laser oder Synchrotronquellen, um diese hochreaktiven Spezies herzustellen. Hydroxylradikale sind das am häufigsten verwendete unspezifische Reagenz, das in Hydroxyl radical footprinting (HRF)7, 11,12,13 Experimenten angewendetwurde,um eine breite Palette von Proteinen und Proteinkomplexen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu untersuchen.
Unsere Forschungsgruppe hat erfolgreich ein weiteres relativ unspezifisches Reagenz namens Diethylpyrocarbonat (DEPC) verwendet, um die Proteinstruktur und -wechselwirkungen im Rahmen der CL-MS-Experimente14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25zuuntersuchen. DEPC bietet die Einfachheit spezifischer Markierungsreagenzien (d.h. es ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich, um die Reaktionen durchzuführen), während es mit bis zu 30% Aminosäuren im durchschnittlichen Protein reagiert. Als hochelektrophiles Reagenz ist DEPC in der Lage, mit dem N-Terminus und den nukleophilen Seitenketten von Cystein-, Histidin-, Lysin-, Tyrosin-, Serin- und Threoninresten zu reagieren. Typischerweise wird ein einzelnes Produkt dieser Reaktionen erzeugt, was zu einer Massenzunahme von 72,02 Da führt. Diese einzelne Art von Produkt steht im Gegensatz zu den bis zu 55 verschiedenen Produkten, die hergestellt werden können, wenn Proteine mit Hydroxylradikalen reagieren7. Eine solche einfache Chemie erleichtert die Identifizierung von markierten Stellen.
Hier stellen wir Protokolle für die Verwendung von DEPC-basiertem CL-MS zur Verfügung, um Proteinstruktur und -interaktionen zu untersuchen. Details im Zusammenhang mit der Reagenzienvorbereitung, DEPC-Proteinreaktionen, Proteinverdauungsbedingungen, LC-MS- und MS / MS-Parametern und Datenanalyse werden beschrieben. Wir demonstrieren auch den Nutzen der DEPC-Markierung, indem wir Beispielergebnisse aus Protein-Metall-, Protein-Liganden- und Protein-Protein-Interaktionen sowie Protein-Protein-Interaktionen liefern, die beim Erhitzen strukturelle Veränderungen erfahren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte
Mehrere Punkte in Bezug auf das experimentelle Design sollten berücksichtigt werden, um zuverlässige Kennzeichnungsergebnisse zu gewährleisten. Erstens, um die Proteinmarkierung zu maximieren, ist es notwendig, Puffer mit stark nukleophilen Gruppen (z. B. Tris) zu vermeiden, da sie mit DEPC reagieren und das Ausmaß der Markierung verringern können. Es ist auch denkbar, dass solche Puffer mit markierten Rückständen reagieren könnten, was zur Entfernung des Etiketts und damit zum Verl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bestätigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) unter Grant R01 GM075092. Das Thermo Orbitrap Fusion Massenspektrometer, mit dem einige der hier beschriebenen Daten erfasst wurden, wurde mit Mitteln des National Institutes of Health Grant S10OD010645 erworben.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
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