Summary
Vengono descritte le procedure sperimentali per l'esecuzione di etichette covalenti a base di dietilpirrocarbonato con rilevamento spettrometrico di massa. Il dietilpirrocarbonato viene semplicemente miscelato con il complesso proteico o proteico di interesse, portando alla modifica di residui di amminoacidi accessibili al solvente. I residui modificati possono essere identificati dopo la digestione proteolitica e l'analisi della cromatografia liquida/spettrometria di massa.
Abstract
Caratterizzare la struttura di ordine superiore di una proteina è essenziale per comprenderne la funzione. La spettrometria di massa (SM) è emersa come un potente strumento a questo scopo, specialmente per i sistemi proteici che sono difficili da studiare con i metodi tradizionali. Per studiare la struttura di una proteina da parte della SM, vengono eseguite reazioni chimiche specifiche in soluzione che codificano le informazioni strutturali di una proteina nella sua massa. Un approccio particolarmente efficace è quello di utilizzare reagenti che modifichino covalentemente catene laterali di amminoacidi accessibili ai solventi. Queste reazioni portano ad aumenti di massa che possono essere localizzati con risoluzione a livello di residuo se combinati con digestione proteolitica e spettrometria di massa tandem. Qui descriviamo i protocolli associati all'uso del dietilpirocarbonato (DEPC) come reagente di etichettatura covalente insieme al rilevamento MS. Il DEPC è una molecola altamente elettrofila in grado di etichettare fino al 30% dei residui nella proteina media, fornendo così un'eccellente risoluzione strutturale. Il DEPC è stato utilizzato con successo insieme alla SM per ottenere informazioni strutturali per piccole proteine monodominio, come la β2-microglobulina, a grandi proteine multidominio, come gli anticorpi monoclonali.
Introduction
Le proteine sono biomolecole essenziali praticamente in ogni processo fisiologico. La varietà di funzioni che le proteine svolgono sono possibili a causa delle strutture che adottano e delle interazioni che hanno con altre biomolecole. Per comprendere la funzione proteica a un livello più profondo, sono necessari strumenti biochimici e biofisici per chiarire queste importanti caratteristiche strutturali e interazioni. Tradizionalmente, la cristallografia a raggi X, la microscopia elettronica criogenica e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) hanno fornito i dettagli desiderati a livello atomico per rivelare la struttura proteica. Tuttavia, numerosi sistemi proteici non possono essere interrogati da queste tecniche a causa dello scarso comportamento di cristallizzazione, della limitata disponibilità di proteine, dell'eccessiva eterogeneità del campione o delle limitazioni di peso molecolare. Di conseguenza, sono emersi metodi di analisi più nuovi che superano questi limiti. Tra le tecniche emergenti che possono fornire informazioni strutturali sulle proteine c'è la spettrometria di massa.
La spettrometria di massa (SM) misura il rapporto massa-carica (m/z) di una molecola, quindi le informazioni strutturali di ordine superiore delle proteine devono essere ottenute codificando le informazioni strutturali desiderate nella massa della proteina. Sono stati sviluppati diversi approcci per codificare queste informazioni, tra cui lo scambio idrogeno-deuterio (HDX)1,2,3,4, il crosslinking chimico (XL)5,6e l'etichettatura covalente (CL)7,8,9,10. In HDX, gli idrogenati di ammide dorsale vengono scambiati da deuterio leggermente più massicci a tassi che dipendono dall'accessibilità dei solventi e dall'estensione del legame H. L'estensione dell'HDX può essere localizzata digerendo rapidamente la proteina in frammenti peptidici prima di separare e misurare questi frammenti dallo spettrometro di massa o dissociando la proteina in un esperimento dall'alto verso il basso. Determinare il tasso di cambio fornisce ulteriori informazioni sulla dinamica proteica. HDX ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per caratterizzare la struttura proteica nonostante le sfide associate allo scambio posteriore e la necessità di apparecchiature specializzate per massimizzare la riproducibilità. In XL-MS, le proteine reagisce con reagenti bifunzionali che collegano covalentemente catene laterali di residui adiacenti all'interno di una data proteina o tra due proteine. In questo modo, XL-MS può fornire vincoli di distanza che possono essere utilizzati per caratterizzare la struttura proteica. Le regioni della proteina che sono reticate possono essere identificate dalla digestione proteolitica seguita da analisi della cromatografia liquida (LC)-MS. Mentre XL-MS è uno strumento versatile che è stato utilizzato per studiare una varietà di complessi proteici, tra cui celle interne, l'identificazione dei prodotti XL è impegnativa e richiede software specializzato.
Cl-MS è emerso di recente come uno strumento complementare e talvolta alternativo basato sulla SM per studiare la struttura e le interazioni proteiche. In CL-MS, un complesso proteico o proteico viene modificato covalentemente con un reagente monofunzionale in grado di reagire con catene laterali esposte al solvente (Figura 1). Confrontando le estensioni di modifica di un complesso proteico o proteico in diverse condizioni, è possibile rivelare cambiamenti di conformazione, siti di legame e interfacce proteina-proteina. Dopo la reazione CL, le informazioni specifiche del sito, spesso a livello di singolo amminoacido, possono essere ottenute utilizzando i tipici flussi di lavoro di proteomica bottom-up in cui le proteine vengono digerite proteoliticamente, i frammenti peptidici sono separati da LC e i siti modificati vengono identificati utilizzando la SM tandem (MS/MS). La ricca storia della chimica bioconiutogata ha reso disponibili numerosi reagenti per esperimenti CL-MS. I reagenti CL si suddividono in due categorie generali: i) specifiche e (ii) non specifiche. Reagenti specifici reagiscono con un singolo gruppo funzionale (ad esempio, ammine libere)8,10 e sono facili da implementare, ma tendono a fornire informazioni strutturali limitate. Reagenti non specifici reagiscono con una vasta gamma di catene laterali, ma spesso richiedono attrezzature specializzate come laser o sorgenti di sincrotrone per produrre queste specie altamente reattive. I radicali idrossilici sono il reagente non specifico più comunemente usato, essendo stati applicati in impronte di radicali idrossilici (HRF)7,11,12,13 esperimenti per studiare una vasta gamma di proteine e complessi proteici in una varietà di condizioni.
Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato con successo un altro reagente relativamente non specifico chiamato dietilpirocarbonato (DEPC) per studiare la struttura proteica e le interazioni nel contesto degli esperimenti CL-MS14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC offre la semplicità di reagenti specifici per l'etichettatura (cioè, non è necessaria alcuna apparecchiatura specializzata per eseguire le reazioni), reagendo con fino al 30% di amminoacidi nella proteina media. Come reagente altamente elettrofilo, il DEPC è in grado di reagire con il N-terminale e le catene laterali nucleofile di cisteina, istidina, lisina, tirosina, serina e residui di treonina. Tipicamente, viene generato un singolo prodotto di queste reazioni, con un aumento di massa di 72,02 Da. Questo singolo tipo di prodotto contrasta con i fino a 55 diversi prodotti che possono essere prodotti quando le proteine reagiscono con radicali idrossilici7. Tale chimica semplice facilita l'identificazione dei siti etichettati.
Qui, forniamo protocolli per l'utilizzo di CL-MS basato su DEPC per studiare la struttura e le interazioni proteiche. Vengono descritti i dettagli associati alla preparazione dei reagenti, alle reazioni depc-proteina, alle condizioni di digestione proteica, ai parametri LC-MS e MS/MS e all'analisi dei dati. Dimostriamo anche l'utilità dell'etichettatura DEPC fornendo risultati di esempio dalle interazioni proteina-metallo, proteina-ligando e proteina-proteina, nonché proteine che subiscono cambiamenti strutturali al riscaldamento.
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Protocol
1. Preparazione di proteine e reagenti
NOTA: questo protocollo include un flusso di lavoro di esempio per l'etichettatura di una proteina con DEPC. Alcune condizioni e concentrazioni di reagenti elencate possono variare in base alla proteina scelta.
- Preparare tutte le soluzioni di reagente in tubi microcentrifugo da 1,5 ml.
- Preparare una soluzione proteica della concentrazione desiderata, di solito nell'intervallo di decine di μM, in un tampone di acido propanosolfonico (MOPS) 10 mM 3-(N-morfolino) a pH 7,4. In alternativa, preparare una soluzione proteica esistente a scambio tampone in MOPS 7.4 pH 10 mM se il campione contiene un tampone nucleofilo che sarebbe reattivo con DEPC. Possono essere utilizzati anche altri tamponi (ad esempio, salina tamponata con fosfato), purché non abbiano gruppi funzionali nucleofili.
- Preparare una soluzione DEPC da 100 mM in acetonitrile secco (ACN) pipettando 1,45 μL della soluzione DEPC stock 6.9 M in 98,55 μL dell'ACN.
NOTA: Non esiste un insieme di concentrazioni che funzioni con ogni proteina, anche se le concentrazioni ottimali possono essere stimate in base al numero di residui di His e Lys23. Ad esempio, con 50 μL di una soluzione di β2-microglobulina da 50 μM, reagire alla proteina con 0,2 μL del DEPC da 100 mM per una concentrazione finale di DEPC di 200 μM (pari a 4 volte la concentrazione proteica) per garantire il rapporto molare desiderato utilizzando questo esempio generale(tabella 1). L'etichettatura DEPC è una reazionedi 2 ° ordine, quindi cambiare la concentrazione di proteine o DEPC nella miscela di reazione cambierà il tasso di etichettatura. - Preparare 1 M di soluzione di imidazolo pesando 10 mg di imidazolo e sciogliendo in 146,9 μL di acqua di grado HPLC.
2. Etichettatura covalente di proteine intatte
- Impostare la temperatura del bagno d'acqua a 37 °C e attendere che il bagno raggiunga una temperatura stabile.
NOTA: Le concentrazioni e i volumi dei reagenti per un protocollo di etichettatura di esempio sono disponibili nella tabella 1. - In un nuovo tubo di microcentrifugo, mescolare tampone MOPS e soluzione proteica in volumi elencati nella tabella 1.
- Alla proteina e al tampone aggiungere 0,2 μL della soluzione DEPC, assicurandosi di mescolare correttamente la soluzione risultante, quindi posizionare il tubo contenente la miscela di reazione nel bagno d'acqua di 37 °C per 1 minuto.
NOTA: Il volume di ACN aggiunto non deve superare l'1% del volume totale di reazione per evitare perturbazioni della struttura della proteina durante la reazione di etichettatura. Il tempo di reazione è all'utente, anche se una reazione di 1 minuto nelle condizioni di esempio riduce al minimo l'etichettatura eccessiva e la potenziale idrolisi di DEPC14. - Dopo 1 minuto, rimuovere il tubo contenente la miscela di reazione dal bagno d'acqua e spegnere la reazione con 1 μL della soluzione di imidazolo da 1 M per scavengere il DEPC non reatto rimanente.
NOTA: La concentrazione finale di imidazolo nella miscela di reazione deve essere pari a 50 volte la concentrazione di DEPC nella miscela di reazione. Ciò garantirà che il DEPC non transazionato rimanga scavenged.
3. Preparazione del digestione proteica per l'LC-MS dal basso verso l'alto
NOTA: Scegliere condizioni di digestione che siano suscettibili alla proteina di interesse. I passi comuni prevedono lo spiegamento della proteina e la riduzione e l'alchilazione di eventuali legami disolfuro.
- Aprire la proteina aggiungendo un reagente dispiegabile appropriato alla miscela di reazione.
NOTA: Gli agenti di spiegamento comuni includono ACN, urea e cloridrato di guanidina (GuHCl). - Preparare soluzioni di Tris(2-carbossietile)fosfina (TCEP) e iodoacetamide (IAM) pesando 5 mg ciascuno e sciogliendoli in nuovi tubi a microcentrifugo rispettivamente in 174,4 e 270,3 μL di tampone MOPS da 10 mM pH 7,4 per le fasi di riduzione e alchilazione.
- Ridurre i legami disolfuro aggiungendo 2 μL della soluzione TCEP da 100 mM (concentrazione finale di 2 mM in miscela di reazione) alla miscela di reazione e reagendo per 3 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: La concentrazione finale di TCEP deve essere pari a 40 volte la concentrazione proteica per legame disolfuro presente nella soluzione. - Alchilato ridotto cisteine con 4 μL della soluzione IAM da 100 mM (concentrazione finale di 4 mM in miscela di reazione) per 30 minuti al buio. L'IAM è sensibile alla luce e si decompone sotto la luce diretta.
NOTA: La concentrazione finale di IAM in soluzione deve essere il doppio della concentrazione utilizzata per il TCEP, o 80 volte la concentrazione proteica per legame disolfuro. - Digerire la proteina con un enzima appropriato come la trippatina o la chimotripsina. Un rapporto proteina-enzima di 10:1 per una digestione di 3 ore a 37 °C con enzima immobilizzato ad una velocità di scuotimento di 300 colpi/min è tipicamente sufficiente per le proteine etichettate DEPC. Vedi Discussione.
- Dopo la digestione, separare l'enzima immobilizzato dai peptidi digeriti per centrifugazione a 12.000 giri/min per 5 minuti.
- Analizzare immediatamente il campione tramite LC-MS/MS o congelare il campione con azoto liquido per ridurre al minimo la degradazione del campione e la perdita di etichette. Conservare i campioni congelati a < -20 °C fino a quando non sono pronti per l'analisi LC-MS/MS.
4. Analisi LC-MS/MS
NOTA: I parametri standard LC-MS/MS per la proteomica dal basso verso l'alto possono essere utilizzati per identificare siti etichettati sui frammenti peptidici proteolitici. Di seguito viene illustrato un esempio generale.
- Separare i peptidi etichettati DEPC utilizzando una fase stazionaria C18 in fase invertita. Utilizzare una tipica fase mobile LC di due solventi: (A) acqua + 0,1% acido formico e (B) ACN + 0,1% acido formico utilizzando un gradiente (ad esempio, figura 2)per ottenere la migliore separazione dei peptidi.
NOTA: Il tempo di separazione può essere ottimizzato in base alla complessità del campione e la portata di fase mobile dipende dall'utilizzo di capillare o nano LC. - Utilizzare uno spettrometro di massa in grado di eseguire LC-MS on-line e MS/MS per identificare i siti di modifica DEPC sul peptide. Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato con successo diversi tipi di spettrometri di massa. Qualsiasi spettrometro di massa in grado di eseguire automaticamente MS/MS di molti peptidi nel corso di un'analisi LC-MS dovrebbe essere adatto. I parametri MS rilevanti includono: tensione di sorgente ESI = -4000 V per l'ESI regolare; -2000 V per nanospray; Risoluzione orbitrap = 60.000; Durata di esclusione dinamica = 30 s; Tipo di attivazione MS/MS: CID, ETD o entrambi; Intervallo di scansione di massa = 200-2.000; Controllo automatico del guadagno = 4,0E5 (MS1 in Orbitrap) e 5,0E4 (MS2 nella trappola ionica quadrupolo lineare).
- Caricare e iniettare il campione proteico digerito ed etichettato nel sistema LC e avviare l'acquisizione LC-MS/MS. Se il campione è stato congelato in flash, scongelare prima dell'analisi. Deviare l'effluente LC in rifiuti per i primi 5 minuti per evitare che sali eccessivi possano entrare nella fonte ESI.
NOTA: Un circuito di iniezione di 5 μL è generalmente utilizzato, consentendo l'iniezione di circa 2,5 μg di proteine alla LC-MS/MS. Ciò dipende dalle condizioni di carico dell'LC per non ostruire l'iniettore del campione.
5. Analisi dei dati
- Identificare i siti di etichette DEPC e quantificare le aree di picco peptidice utilizzando un software appropriato per lo spettrometro di massa utilizzato.
- Includere l'addizione DEPC (72,02 Da) e la carbamidometilazione (57,02 Da) come modifiche variabili. Ulteriori parametri di ricerca per l'analisi MS/MS sono i seguenti: Scollatura massima persa = 3; Tipi di ioni frammentazione = b e y; Tolleranza precursore m/z = 10 ppm (questo valore dovrebbe essere più alto se viene utilizzato uno spettrometro di massa a trappola ionica quadrupolo); Tolleranza m/z del frammento = 0,5 Da (questo valore deve essere inferiore se per una scansione ionica del prodotto viene utilizzato uno spettrometro di massa ad alta risoluzione); Carica precursore = 1-4.
NOTA: diversi algoritmi di ricerca di database hanno sistemi di punteggio diversi e molti possono avere difficoltà a identificare peptidi modificati da DEPC perché i livelli di modifica possono essere bassi. La regolazione del taglio del punteggio può essere necessaria per identificare peptidi più etichettati. In tal caso, l'interrogazione manuale dei dati MS/MS deve essere utilizzata per verificare peptidi a basso punteggio. Il prodotto dell'idrolisi dell'etichetta DEPC non è incluso nella ricerca dei dati perché il DEPC idrolizzato non è più reattivo verso le catene laterali nucleofile. - Determinare le percentuali di modifica del livello di residui utilizzando le aree di picco cromatografiche delle versioni modificate e non modificate dei peptidi.
NOTA: Qualsiasi peptide contenente il residuo di interesse modificato deve essere preso in considerazione e tutti gli stati di carica inclusi devono essere presenti in tutti i campioni misurati. I peptidi con diverse efficienze di ionizzazione ed eluizione in momenti diversi fa sì che questo valore sia una misura relativa piuttosto che assoluta della modifica di un sito specifico.
dove Ai,z rappresenta l'area di picco di un dato peptide (i) che contiene il residuo di interesse e considera tutti gli stati di carica rilevati (z). - Determinare se una modifica dell'etichettatura tra un controllo e un campione sperimentale è significativa utilizzando la valutazione statistica. Tre misurazioni di replica per ogni campione sono tipiche e i test t sono più comunemente utilizzati con intervalli di confidenza del 95 o 99%.
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Representative Results
Identificazione dei siti di modifica DEPC e delle percentuali di modifica
L'aggiunta di massa dovuta all'etichettatura covalente può essere misurata ai livelli di (a) proteina intatta e (b) peptidici8,9. A livello intatto, una distribuzione di specie proteiche con un numero diverso di etichette può essere ottenuta dall'analisi diretta o LC-MS di campioni proteici etichettati. Per ottenere informazioni strutturali a risoluzione più elevata (ad esempio, dati di etichettatura specifici del sito), le misurazioni devono essere eseguite a livello peptidico. Dopo le fasi di etichettatura e tempra, le proteine etichettate vengono sottoposte ad analisi proteomiche dal basso verso l'alto (ad esempio, riduzione del disolfuro, alchilazione, digestione proteolitica e LC-MS /MS). La figura 3 mostra come vengono identificati i siti etichettati DEPC e i loro livelli di modifica sono calcolati per un esperimento CL-MS DEPC sulla proteina β-2-microglobulina (β2m)21. La SM/MS viene utilizzata per sequenziare i peptidi etichettati e individuare i loro siti etichettati DEPC, mentre le percentuali di modifica sono calcolate dalle loro aree di picco relative nei cromatogrammi di ioni estratti (vedere figura 3A).
Mappatura delle superfici proteiche con DEPC CL-MS
A causa della relazione tra topologia proteica e tasso di etichettatura, DEPC è stato utilizzato per studiare i cambiamenti nella struttura di ordine superiore delle proteine (HOS) e identificare i siti diinterazione proteica 8,9. Un esempio è l'effetto del legame Cu(II) sulla struttura di β2m. I coefficienti di velocità di modifica DEPC dei frammenti peptidici provenienti da β2m non legati e β2m (b2m-Cu) non legati a Cu possono essere misurati(tabella 2)variando le concentrazioni di DEPC e generando particelle cinetiche di secondoordine 14,24. La reattività DEPC dei residui in β2m-Cu rivela significative variazioni del tasso di etichettatura per His31, Ser33 e Thr4, mentre altri siti, inclusi diversi residui di His, sono statisticamente invariati. Questi dati sono coerenti con il fatto che His31, ma non altri Suoi residui in β2m, lega Cu causando cambiamenti strutturali vicino a His31 (cioè Ser33) e vicino al N-terminale (cioè, Thr4) (Figura 4)14,26,27.
DEPC CL-MS per l'identificazione delle modifiche in HOS
L'etichettatura DEPC con rilevamento MS è anche uno strumento prezioso per caratterizzare i cambiamenti HOS alle proteine, che ha importanti implicazioni per le terapie proteiche, che sono attualmente il segmento in più rapida crescita del mercatofarmaceutico 28. DEPC CL è in grado di identificare specifiche regioni proteiche che subiscono cambiamenti strutturali sullo stress termico eossidativo 18. Dopo che β2m è esposto allo stress da calore, molti residui che subiscono significative diminuzioni nelle estensioni di etichettatura (N-terminale, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) sono raggruppati su un lato della proteina, suggerendo che questa regione della proteina subisce un cambiamento conformazionale o possibilmente un'aggregazione mediata (Figura 5A). Oltre a questi residui, dopo che la proteina è stata esposta a stress ossidativo, altri residui con una diminuzione dell'etichettatura (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) formano un ammasso su un'altra faccia della proteina, indicando che i cambiamenti conformazionali indotti dall'ossidazione si verificano altrove(figura 5B). Altri lavori del nostro gruppo hanno anche dimostrato che DEPC CL-MS è in grado di rilevare e identificare siti di cambiamenti conformazionali nelle terapie anticorpali monoclonali stressate dal calore20.
DEPC CL-MS per studiare le interazioni proteina-proteina
Informazioni sui siti di interazione proteina-proteina e sulle interfacce di aggregazione per le proteine che formano amiloide possono essere ottenute utilizzando l'etichettatura DEPCe 9. Le diminuzioni dei livelli di modifica dei residui alla formazione di oligomeri possono rivelare le interfacce di legame. DEPC CL-MS è stato utilizzato per caratterizzare gli oligomeri pre-amiloide di β2m, che è la proteina che forma amiloidi nell'amiloidosi correlata alla dialisi29, dopo aver iniziato la formazione amiloide con Cu(II)15,16,26. Confrontando la reattività DEPC del monomero β2m con il dimero pre-amiloide β2m che si forma 2 ore dopo l'aggiunta di Cu(II) si dimostra che nove residui subiscono una diminuzione dell'etichettatura, mentre sei residui non subiscono variazioni o lievi aumenti dell'etichettatura(figura 6A). Dopo aver mappato queste modifiche su β2m, è immediatamente evidente che l'interfaccia del dimero coinvolge i fogli β ABED dei monomeri β2m (Figura 6B)15.
DEPC CL-MS per studiare il legame proteina-ligando
Il legame del ligando alle proteine porta a diminuzioni nell'accessibilità con solvente dei residui che interagiscono con il ligando, e cl-MS basato su DEPC può essere usato per identificare siti leganti ligandi sulle proteine. Ad esempio, i siti di legame dell'epigallocatechina-3-gallato (EGCG) su β2m in condizioni di formatura amiloide possono essere identificati da diminuzioni significative dell'etichettatura DEPC ai residui sepolti dal legame EGCG. In presenza di ECGC, Lys6 e Lys91 hanno percentuali di modifica DEPC più basse (Figura 7), e questi residui sono raggruppati in una regione della proteina, indicando la protezione dei residui dovuta al legame del ligando. L'N-terminale, Thr4 e His31, nel frattempo, subiscono aumenti nelle estensioni di etichettatura (Figura 7), che sono indicative di cambiamenti strutturali indotti da ECGC e suggeriscono che i siti di legame Cu(II) su β2m (N-terminale e His31)14,30,31 possono essere interrotti a causa del legame ECGC32. Inoltre, i siti di legame degli altri due inibitori a piccole molecole di formazione amiloide β2m, rifamicina SV e doxiciclina, sono stati identificati utilizzando CL-MS19. In questo studio, tuttavia, i risultati dell'etichettatura DEPC da soli non sono stati sufficienti per mappare i siti di legame con una risoluzione strutturale sufficiente. I risultati di tre diversi reagenti CL, vale a dire DEPC, BD e 1-etile-3-(3-(dimetilamino)propil)carbodiimide - estere etilico glicina (EDC/GEE) sono stati necessari per individuare meglio i siti dilegame 19.
Migliorare la risoluzione strutturale e ridurre il rimescolamento delle etichette
Anche se l'etichettatura DEPC causa la formazione di un legame covalente, può verificarsi una perdita di etichetta dovuta all'idrolisi, specialmente per i residui di Ser, Thr e Tyr(Figura 8). La perdita di etichette può essere minimizzata diminuendo il tempo tra la reazione CL DEPC e l'analisi LC-MS utilizzando brevi digestione proteolitica (ad esempio, digestione 2 ore con enzimi immobilizzati) piuttosto che digestione durante la notte. La digestione rapida si traducono in una misura di residui più modificati, aumentando la quantità di informazioni strutturali sulle proteine. Ad esempio, una digestione di 2 ore con chimotripsina immobilizzata porta costantemente all'identificazione di più residui modificati con DEPC in β2m (Figura 9)17. Con una digestione notturna vengono rilevati circa il 75% dei residui di Ser, Thr, Tyr, His e Lys in β2m, ma quando il tempo tra l'etichettatura e l'LC-MS viene ridotto utilizzando una digestione di 2 ore, viene rilevato il 95% di questi residui in β2m. La maggior parte dei residui modificati appena rilevati sono residui di Tyr e Thr soggetti a idrolisi.
Nel corso del nostro lavoro con la DEPC, abbiamo notato che in alcune proteine, i residui di Cys che dai legami disolfuro sono modificati dal DEPC, anche se i legami disolfuro sono intatti durante le reazioni di etichettatura DEPC. Tale etichettatura dei residui di Cys avviene perché i tioli liberi possono reagire con altri residui modificati in soluzione (Figura 10), portando al cosiddetto "scrambling delle etichette" poiché il gruppo carbetossico viene trasferito al residuo di Cys. Lo scrambling delle etichette riduce i livelli di modifica ad altri residui e fornisce informazioni strutturali sulle proteine errate. Per evitare il rimescolamento dell'etichetta, i tioli Cis liberi devono essere completamente alchilati subito dopo la riduzione del disolfuro33.
Figura 1: Spettrometria covalente di massa di etichettatura (CL-MS). Un reagente monofunzionale viene utilizzato per modificare gli amminoacidi accessibili ai solventi e può essere utilizzato per fornire informazioni specifiche del sito sui cambiamenti conformazionali o sulle interfacce di interazione nelle proteine (immagine superiore o inferiore). La proteina modificata viene digerita proteoliticamente e i peptidi risultanti vengono analizzati mediante cromatografia liquida (LC) in combinazione con MS e TANDEM MS (MS/MS). La figura è stata adattata da Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Interactions. Metodi 144, 79-93 (2018). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Volume utilizzato (μL) | Concentrazione in soluzione (μM) | |
| Proteine (100 μM, MOPS) | 50 | 50 |
| MOPS (10 mM, pH 7,4) | 48.8 | n/d |
| DEPC (100 mM) | 0.2 | 200 (=4x[proteina]) |
| Imidazolo (1 M) | 1 | 10.000 (=50x[DEPC]) |
| Volume totale | 100 |
La tabella 1. Protocollo di etichettatura DEPC generale.
Figura 2. Esempio di gradiente LC per la separazione dei peptidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Illustrazione di come vengono identificati i siti etichettati DEPC e vengono calcolati i loro livelli di modifica. Dopo l'etichettatura DEPC e la digestione proteolitica, viene eseguita l'analisi LC-MS (A) della proteina digerita. Per calcolare la percentuale di etichettatura vengono utilizzate aree di picco di peptidi (B) non etichettati e (C) etichettati in un cromatogramma. Durante l'LC-MS, i peptidi sono sottoposti a CID MS/MS. Gli spettri di massa tandem di peptidi etichettati (D) non etichettati e (E) & (F) ottenuti in tempi di ritenzione specifici vengono utilizzati per il sequenziamento peptidico e l'identificazione di siti etichettati DEPC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| residuo | b2m | b2m-Cu |
| Thr4 | 0,082 ± 0,004 | 0,052 ± 0,009 |
| His13 | 0,041 ± 0,003 | 0,033 ± 0,005 |
| His31 | 0,010 ± 0,001 | 0,003 ± 0,001 |
| Ser33 | 0,010 ± 0,002 | 0,004 ± 0,001 |
| His51 | 0,036 ± 0,003 | 0,030 ± 0,004 |
| Ser88 | 0,029 ± 0,007 | 0,020 ± 0,006 |
Tabella 2 : La commissione per i dati Coefficienti di velocità di modifica DEPC specifici del sito (k, M-1s-1) per b2m in assenza e presenza di Cu(II).
Figura 4 Utilizzo di CL-MS DEPC per determinare l'effetto del legame Cu(II) sulla struttura di β2m: (A) Mappatura superficiale proteica dei residui con diminuzioni significative dei tassi di etichettatura DEPC (blu), indicando cambiamenti nella loro accessibilità al solvente al legame Cu(II) e quelli senza variazioni significative nel tasso di etichettatura (magenta) (codice di adesione PDB 1JNJ). (B) Esempi di particelle cinetiche di secondo ordine specifiche del sito della reazione di β2m con diverse concentrazioni di DEPC in presenza e assenza di Cu(II). Il coefficiente di velocità di etichettatura (k) può essere ottenuto dalla pendenza del grafico cinetico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 Risultati dell'etichettatura covalente per sollecitazioni rispetto a β2m autoctone: (A) Stress da calore - riscaldamento a 75 °C per sollecitazioni ossidativi 24 ore e (B) - con 3% H2O2 per 24 h. Variazioni significative delle percentuali di modifica sono mostrate in blu (diminuzione dell'etichettatura) e rosso (aumento dell'etichettatura) mentre i residui senza modifiche significative dell'etichettatura sono mostrati in verde pallido (codice di adesione PDB 1JNJ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 Usando DEPC CL-MS per determinare l'interfaccia del dimero per il dimero pre-amiloide di β2m: (A) Riepilogo delle variazioni del livello di modifica depc per i residui modificati nel monomero (cioè, t = 0) e dimero 2 h dopo l'aggiunta di Cu(II). I residui con diminuzioni significative nell'estensione dell'etichettatura sono denotati da un asterisco (*). (B) Risultati dell'etichettatura covalente mappati sulla struttura β2m. I residui con diminuzione dell'etichettatura sono indicati in blu e i residui senza modifiche o lievi aumenti dell'etichettatura sono mostrati in rosso (codice di adesione PDB 1LDS). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 Risultati dell'etichettatura covalente per b2m associato a EGCG e non associato. Le percentuali di modifica DEPC sono indicate per i residui visualizzati. Differenze statisticamente significative nella percentuale di etichettatura covalente sono denota da un asterisco (*). Gli aumenti dell'etichettatura sull'associazione ECGC sono mostrati in rosso mentre le diminuzioni sono mostrate in blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 Reazioni di etichettatura covalente DEPC (sostituzione nucleofila dell'acil) e perdita di etichette (idrolisi dei residui carbetossilati) Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra.
Figura 9 Mappatura dei siti di modifica misurati su β2m. (A) Siti etichettati dopo la digestione notturna convenzionale e (B) siti etichettati dopo una digestione di 2 ore con chimotripsina immobilizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10 Meccanismo ipotizzato del rimescolamento dell'etichetta DEPC (cattura Cys del carbetossilato His) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Passaggi critici
Per quanto riguarda la progettazione sperimentale, si dovrebbero prendere in considerazione diversi punti per garantire risultati di etichettatura affidabili. In primo luogo, per massimizzare l'etichettatura delle proteine, è necessario evitare tamponi con gruppi fortemente nucleofili (ad esempio Tris) perché possono reagire con DEPC e abbassare l'estensione dell'etichettatura. È anche concepibile che tali tamponi possano reagire con residui etichettati, causando la rimozione dell'etichetta e quindi la perdita di informazioni strutturali. Si consiglia MOPS come tampone, ma funziona anche la salina tamponata con fosfato. In secondo luogo, il ditiothreitol dovrebbe essere evitato per la riduzione dei legami disolfuro perché i tioli liberi in questo reagente possono reagire con residui etichettati e rimuovere la modifica del DEPC. Questa stessa chimica è il motivo per cui è essenziale alchilato disolfuri ridotti perché cys libero può causare il rimescolamento dell'etichetta intra-proteina33. In terzo luogo, il passo di tempra con imidazolo (fase del protocollo 2.4) è fondamentale per fermare la reazione di etichettatura, quindi qualsiasi DEPC rimanente non è in grado di continuare a reagire con la proteina.
È anche importante comprendere che la reazione di etichettatura DEPC è di secondo ordine, il che significa chela modifica della concentrazione di proteine o DEPC influenzerà l'estensione dell'etichettatura. Abbiamo empiricamente scoperto che un rapporto di concentrazione di 4:1 DEPC:protein è un valore ragionevole quando la proteina ha una concentrazione negli anni '10 dell'intervallo μM, in quanto tende ad evitare qualsiasi cambiamento strutturale indotto dall'etichettatura14. Tuttavia, il rapporto ottimale di concentrazione DEPC:protein è dipendente dalle proteine e dalla concentrazione, e alcune proteine richiedono rapporti più elevati per ottenere un'etichettatura sufficiente. La concentrazione ottimale di DEPC per ridurre al minimo la perturbazione strutturale dell'etichettatura di una data proteina può essere stimata dal numero di residui His e Lys accessibili al solvente23.
Per evitare la variabilità nelle estensioni di etichettatura dovuta alla degradazione del reagente nel tempo, il controllo e le reazioni sperimentali dovrebbero idealmente essere eseguiti lo stesso giorno. Il DEPC subisce una rapida idrolisi quando esposto all'acqua e si degrada anche durante lo stoccaggio, quindi una buona pratica di laboratorio e la manipolazione dei reagenti sono fondamentali. Quando non è in uso, la bottiglia di magazzino DEPC deve essere conservata in un essiccatore.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Poiché DEPC CL è una reazione cineticamente controllata, la velocità di etichettatura, e quindi il livello di modifica, sono controllati da concentrazioni proteiche e reagenti, tempo di etichettatura e temperatura. Come indicato sopra, spesso DEPC CL viene eseguito per 1 minuto a 37 °C con un rapporto molare DEPC-proteina da 4 a 1. A questo rapporto molare (4x), le proteine possono essere etichettate in modo sicuro senza perturbazionistrutturali 14. I rapporti molari DEPC:protein che sono maggiori di 4 possono essere utilizzati per alcune proteine, e non sorprende che concentrazioni di DEPC più elevate si traducano in un'etichettatura più estesa e in informazioni più strutturali. Il modo più sicuro per utilizzare concentrazioni di DEPC più elevate senza struttura perturbata è quello di generare grafici dose-risposta in cui la reattività dei frammenti proteolitici di una proteina viene misurata in funzione della concentrazione di DEPC (vedi figura 4B)14,24. Tuttavia, questo approccio può richiedere molto tempo, in quanto richiede più misurazioni. Recentemente, abbiamo dimostrato che la concentrazione ottimale di DEPC può essere stimata per una data proteina dal numero e dai residui SASA dei suoi e Lys in quella proteina23. In recenti lavori, abbiamo anche suggerito modi alternativi per valutare che la struttura di una proteina non è perturbata durante CL9,24.
La digestione proteolitica è anche un passo importante in DEPC CL-MS, poiché i peptidi generati consentono di localizzare le informazioni strutturali dopo l'analisi LC-MS / MS. In generale, le proteasi della serina come la trippatina e la chimotripsina sono efficaci per la digestione proteica. La tripsiderina è più comunemente usata a causa della sua efficienza di scissione e specificità sul lato C-terminale dei residui di Lys e Arg. Tuttavia, la tripside di solito non si stacca dopo i residui di Lys etichettati DEPC, causando una scollatura mancata ai residui di Lys etichettati che a volte possono complicare l'analisi dei dati. L'attività della chimotripsina, che si stacca dopo ingombranti residui idrofobici, non è tipicamente influenzata dall'etichettatura DEPC, ma questo enzima ha una minore efficienza di scissione e specificità rispetto alla tripparina. Inoltre, per le proteine con numerosi residui idrofobi, la chimotripsina può generare diversi brevi frammenti peptidici che possono essere difficili da separare e rilevare in condizioni standard di LC-MS.
Le analisi LC-ESI-MS/MS dei digestori proteici richiedono un elettrospray stabile per ottenere risultati semiquantitativi affidabili. Capillare e nano LC sono piattaforme di separazione comunemente usate dove è possibile ottenere una separazione efficiente con piccole quantità di proteine. Tuttavia, nella nostra esperienza, l'LC capillare fornisce informazioni quantitative più affidabili (cioè livelli di modifica) rispetto a nano LC a causa delle maggiori quantità di campioni che vengono utilizzate. Per le grandi proteine che vengono digerite in un gran numero di peptidi etichettati e non etichettati, può verificarsi la coeluizione di peptidi con idrofobicità simile. In questi casi, i gradienti LC più lunghi dovrebbero essere utilizzati per separazioni migliori.
La sm/MS veloce ed efficiente è importante per una buona copertura delle sequenze e l'identificazione del sito delle etichette. Gli spettrometri di massa con trappole ioniche quadruppolari sono strumenti eccellenti per questo scopo. Generalmente, il CSI è un metodo comune e altamente efficace per la dissociazione peptidica; tuttavia, abbiamo osservato casi di etichetta DEPC che si rimescolano durante il CSI di ioni peptidici etichettati, con conseguente ambiguità nell'etichettatura dell'identità delsito 34. In questi casi un po 'rari, ETD fornisce informazioni più affidabili. Di conseguenza, se possibile, l'alternanza tra entrambe le tecniche di dissociazione può essere utile. Poiché depc può etichettare molti tipi di residui diversi, è comune che vengono generati isomeri di un dato frammento peptidico che differiscono nella catena laterale che viene modificata. Molte volte, questi isomeri peptidici possono essere separati da LC, anche se tendono ad elutarsi in momenti molto simili. Questa probabilità deve essere presa in considerazione quando si impostano i tempi di esclusione MS/MS durante le analisi automatizzate LC-MS/MS. In genere, devono essere utilizzati tempi di esclusione più brevi del solito.
Limitazioni
Mentre il CL-MS DEPC è tremendamente vantaggioso per lo studio della struttura e delle interazioni proteiche, e sono stati fatti progressi significativi per affrontare un'ampia varietà di sistemi proteici, rimangono alcuni limiti di questa tecnica. Se le condizioni di etichettatura non sono ben ottimizzate (ad esempio, utilizzando una concentrazione troppo elevata di DEPC), l'etichettatura eccessiva può perturbare la struttura proteica e causare informazioni strutturali imprecise14,23,24. Inoltre, l'accuratezza e la precisione dei livelli di modifica misurati sono influenzate da diversi fattori, tra cui la perdita di etichette se i campioni si trovano troppo a lungo prima dell'analisi LC-MS e gli errori nelle fasi di etichettatura chimica. La coerenza in ogni fase sperimentale è importante per risultati affidabili. Uno dei problemi più impegnativi attualmente associati a CL-MS basato su DEPC è il software di analisi dei dati. I programmi di analisi dei dati prontamente disponibili non sono ottimizzati per identificare con successo peptidi con basse percentuali di modifica (ad esempio, < 1%). Di conseguenza, abbiamo sviluppato e utilizzato software specializzato per consentire di identificare facilmente peptidi con bassi livelli di modifica18.
Anche se DEPC CL-MS può fornire una risoluzione strutturale proteica moderata, una struttura 3D dettagliata non può essere ottenuta dalla tecnica di etichettatura. Recentemente, sono stati sviluppati alcuni strumenti di previsione strutturale basati su dati di etichettatura35,36. Tuttavia, sono necessari ulteriori sviluppi per incorporare in modo ottimale i risultati dell'etichettatura DEPC con la modellazione computazionale per prevedere la struttura proteica.
Significato rispetto ai metodi alternativi
La risoluzione strutturale possibile con CL-MS basato su DEPC è moderata rispetto a tecniche come la cristallografia a raggi X o NMR, quindi è più appropriato confrontare la tecnica con gli approcci HDX-MS, XL-MS e altri approcci CL-MS o footprinting. Come accennato nell'introduzione, CL-MS è complementare all'HDX-MS perché fornisce informazioni sulle catene laterali di residui in una proteina, mentre HDX-MS riporta la struttura e la dinamica dorsale. Questa complementarità consente di utilizzare insieme le due tecniche per ottenere maggiori informazioni strutturali, come dimostrato da diversigruppi 37,38,39,40,41. Un'idea emergente rilevante per CL-MS basato su DEPC sono le informazioni sinergistiche disponibili quando vengono utilizzate in combinazione con HDX-MS22. A causa dei tempi di etichettatura associati alle due tecniche, cl-MS basato su DEPC può spesso chiarire ambiguità con le regioni proteiche che subiscono una diminuzione dell'HDX. La diminuzione dell'HDX può derivare da una ridotta accessibilità dei solventi dovuta al legame o da una diminuzione della dinamica proteica. Le reazioni DEPC sono intrinsecamente di 2-3 ordini di grandezza più lente delle reazioni HDX, quindi l'etichettatura DEPC non è in gran parte influenzata dai cambiamenti nella dinamica proteica purché non siano accompagnate da cambiamenti nell'accessibilità dei solventi.
CL-MS ha alcuni vantaggi rispetto agli esperimenti HDX-MS in quel rimescolamento delle etichette e la perdita di etichette sono minime quando vengono prese le precauzioni appropriate. Negli esperimenti HDX, la perdita di etichette o lo scambio posteriore è una caratteristica standard della tecnica, e digestione veloce e separazioni LC a basso pH sono tentativi di ridurre al minimo questo problema. È importante riconoscere, tuttavia, che il problema dello scambio posteriore è controbilanciato dal maggior numero di siti etichettati che vengono in genere misurati in HDX-MS. Lo scrambling dell'etichettatura è un problema più grande in HDX-MS perché si oserebbe quindi ottenere informazioni errate, quindi le condizioni di analisi devono essere ottimizzate per ridurre al minimo questo problema.
XL-MS e CL-MS hanno vantaggi simili per quanto riguarda la perdita e lo scrambling dell'etichetta, poiché entrambi comportano la formazione di un legame covalente abbastanza robusto da rimanere durante la digestione e le analisi LC-MS. Il sequenziamento e l'identificazione dei peptidi retiticosi, tuttavia, è più impegnativo che per i peptidi etichettati covalentemente, che richiedono l'uso di software specializzato. Un vantaggio chiave che XL-MS ha rispetto a CL-MS è la sua capacità di fornire vincoli di distanza, che possono essere preziosi quando si prevedono o si restringono possibili strutture proteiche. I dati CL-MS sono stati utilizzati per facilitare la previsione della strutturaproteica 36,42,43, ma quest'area richiede più lavoro per raggiungere appieno il suo potenziale.
Rispetto ad altri metodi CL-MS, inclusi quelli che utilizzano reagenti di etichettatura specifici o non specifici, DEPC presenta alcuni vantaggi e svantaggi. Come i metodi che utilizzano reagenti specifici degli amminoacidi, l'etichettatura DEPC è semplice; il reagente deve solo essere aggiunto al campione di interesse. Questa semplicità contrasta con metodi come l'ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP) o l'HRF a base di sincrotrone che richiedono sofisticate sorgenti luminose per produrre radicali idrossilici. A differenza dei metodi che utilizzano reagenti specifici, depc può etichettare sei diversi amminoacidi e l'N-terminale, consentendogli di fornire una risoluzione strutturale più elevata. Tuttavia, il numero di residui che possono essere etichettati da DEPC è inferiore al numero che può essere ossidato dai radicali idrossilici, quindi la risoluzione strutturale ottenibile da CL-MS basato su DEPC è inferiore. Una conseguenza pratica di un minor numero di residui etichettati dal DEPC è che l'uso del reagente a volte non fornisce tutte le informazioni strutturali desiderate, e quindi può trarre vantaggio dall'uso in combinazione con altri reagenti di etichettatura. Recentemente abbiamo dimostrato il valore dell'uso del DEPC insieme alla coppia di reagenti 1-etile-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimide (EDC)/etere etilico glicina (GEE), che può etichettare i residui di glutammato e aspartato19.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno dei National Institutes of Health (NIH) nell'ambito di Grant R01 GM075092. Lo spettrometro di massa Thermo Orbitrap Fusion utilizzato per acquisire alcuni dei dati qui descritti è stato acquisito con fondi della sovvenzione dei National Institutes of Health S10OD010645.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
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