Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

Summary

Se describen los procedimientos experimentales para realizar el etiquetado covalente a base de dietilpirocarbonato con detección espectrométrica de masas. El dietilpirocarbonato simplemente se mezcla con la proteína o complejo proteico de interés, lo que lleva a la modificación de residuos de aminoácidos accesibles al disolvente. Los residuos modificados se pueden identificar después de la digestión proteolítica y la cromatografía líquida / análisis de espectrometría de masas.

Abstract

Caracterizar la estructura de orden superior de una proteína es esencial para comprender su función. La espectrometría de masas (EM) ha surgido como una poderosa herramienta para este propósito, especialmente para los sistemas de proteínas que son difíciles de estudiar por métodos tradicionales. Para estudiar la estructura de una proteína por EM, se realizan reacciones químicas específicas en solución que codifican la información estructural de una proteína en su masa. Un enfoque particularmente efectivo es utilizar reactivos que modifican covalentemente las cadenas laterales de aminoácidos accesibles con disolventes. Estas reacciones conducen a aumentos de masa que se pueden localizar con la resolución del nivel de residuos cuando se combinan con la digestión proteolítica y la espectrometría de masas en tándem. Aquí, se describen los protocolos asociados con el uso de dietilpirocarbonato (DEPC) como un reactivo de etiquetado covalente junto con la detección de MS. DEPC es una molécula altamente electrofílica capaz de etiquetar hasta el 30% de los residuos en la proteína media, proporcionando así una excelente resolución estructural. DEPC se ha utilizado con éxito junto con la EM para obtener información estructural de pequeñas proteínas de un solo dominio, como la β2-microglobulina, a grandes proteínas multidominio, como los anticuerpos monoclonales.

Introduction

Las proteínas son biomoléculas esenciales en prácticamente todos los procesos fisiológicos. La variedad de funciones que realizan las proteínas son posibles debido a las estructuras que adoptan y las interacciones que tienen con otras biomoléculas. Para entender la función de la proteína en un nivel más profundo, se necesitan herramientas bioquímicas y biofísicas para dilucidar estas importantes características e interacciones estructurales. Tradicionalmente, la cristalografía de rayos X, la microscopía electrónica criogénica y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) han proporcionado el detalle a nivel atómico deseado para revelar la estructura de la proteína. Sin embargo, numerosos sistemas de proteínas no pueden ser interrogados por estas técnicas debido a un comportamiento de cristalización deficiente, disponibilidad limitada de proteínas, heterogeneidad excesiva de la muestra o limitaciones de peso molecular. En consecuencia, han surgido nuevos métodos de análisis que superan estas limitaciones. Entre las técnicas emergentes que pueden proporcionar información estructural de proteínas se encuentra la espectrometría de masas.

La espectrometría de masas (MS) mide la relación masa-carga (m/z) de una molécula, por lo que la información estructural de orden superior de la proteína debe obtenerse mediante la codificación de la información estructural deseada en la masa de la proteína. Se han desarrollado varios enfoques para codificar esta información, incluyendo el intercambio hidrógeno-deuterio (HDX)^1,2,3,4,reticulado químico (XL)^5,6,y etiquetado covalente (CL)^7,8,9,10. En HDX, los hidrógenos de amida de columna vertebral se intercambian por deuterios ligeramente más masivos a tasas que dependen de la accesibilidad del disolvente y la extensión del enlace H. La extensión de HDX se puede localizar digiriendo rápidamente la proteína en fragmentos del péptido antes de separar y de medir estos fragmentos por el espectrómetro de masa o disociando la proteína en un experimento de arriba hacia abajo. La determinación del tipo de cambio proporciona más información sobre la dinámica de las proteínas. HDX ha demostrado ser una herramienta valiosa para caracterizar la estructura de las proteínas a pesar de los desafíos asociados con el intercambio posterior y la necesidad de equipos especializados para maximizar la reproducibilidad. En XL-MS, las proteínas se reaccionan con reactivos bifuncionales que unen covalentemente las cadenas laterales de residuos adyacentes dentro de una proteína dada o entre dos proteínas. Al hacerlo, XL-MS puede proporcionar restricciones de distancia que se pueden utilizar para caracterizar la estructura de la proteína. Las regiones de la proteína que están reticenladas pueden ser identificadas por digestión proteolítica seguida de cromatografía líquida (LC)-análisis de MS. Si bien XL-MS es una herramienta versátil que se ha utilizado para estudiar una variedad de complejos de proteínas, incluidas las células internas, la identificación de los productos XL es un desafío y requiere un software especializado.

Cl-MS ha surgido recientemente como una herramienta complementaria y a veces alternativa basada en MS para estudiar la estructura de las proteínas y las interacciones. En CL-MS, una proteína o complejo proteico se modifica covalentemente con un reactivo mono-funcional que puede reaccionar con cadenas laterales expuestas al solvente (Figura 1). Al comparar las extensiones de modificación de una proteína o complejo de proteínas bajo diferentes condiciones, se pueden revelar cambios de conformación, sitios de unión e interfaces proteína-proteína. Después de la reacción del CL, la información sitio-específica, a menudo en el solo nivel del aminoácido, se puede obtener usando los flujos de trabajo típicos de la proteómica de abajo hacia arriba en los cuales las proteínas se digieren proteolytically, los fragmentos del péptido son separados por el LC, y los sitios modificados se identifican usando el ms en tándem (MS/MS). La rica historia de la química bioconjugada ha hecho que numerosos reactivos estén disponibles para experimentos cl-ms. Los reactivos cl se dividen en dos categorías generales: (i) específicos y (ii) no específicos. Los reactivos específicos reaccionan con un solo grupo funcional (por ejemplo, aminas libres)^8,10 y son fáciles de implementar, pero tienden a proporcionar información estructural limitada. Los reactivos no específicos reaccionan con una amplia gama de cadenas laterales, pero a menudo requieren equipos especializados como láseres o fuentes de sincrotrón para producir estas especies altamente reactivas. Los radicales hidroxilo son el reactivo inespecífico más comúnmente utilizado, habiéndose aplicado en la huella de radicales hidroxilo (HRF)^7,11,12,13 experimentos para estudiar una amplia gama de proteínas y complejos proteicos bajo una variedad de condiciones.

Nuestro grupo de investigación ha utilizado con éxito otro reactivo relativamente inespecífero llamado dietilpirocarbonato (DEPC) para estudiar la estructura de las proteínas y las interacciones en el contexto de los experimentos CL-MS^{14,15, 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.} DEPC ofrece la simplicidad de reactivos de etiquetado específicos (es decir, no se necesita ningún equipo especializado para realizar las reacciones), mientras que reacciona con hasta un 30% de aminoácidos en la proteína promedio. Como reactivo altamente electrofílico, DEPC es capaz de reaccionar con el N-terminal y las cadenas laterales nucleofílicas de cisteína, histidina, lisina, tirosina, serina y residuos de treonina. Típicamente, se genera un solo producto de estas reacciones, resultando en un aumento de masa de 72.02 Da. Este único tipo de producto contrasta con los hasta 55 productos diferentes que se pueden producir cuando las proteínas reaccionan con los radicales hidroxilo⁷. Esta química simple facilita la identificación de sitios etiquetados.

Aquí, proporcionamos protocolos para el uso de CL-MS basado en DEPC para estudiar la estructura de las proteínas y las interacciones. Los detalles asociados a la preparación del reactivo, a las reacciones de la DEPC-proteína, a las condiciones de la digestión de la proteína, a los parámetros de LC-MS y de MS/MS, y al análisis de datos se describen. También demostramos la utilidad del etiquetado DEPC proporcionando resultados de ejemplo de proteína-metal, proteína-ligando, y las interacciones proteína-proteína, así como las proteínas que sufren cambios estructurales en el calentamiento.

Protocol

1. Preparación de proteínas y reactivos Nota : este protocolo incluye un flujo de trabajo de ejemplo para etiquetar una proteína con DEPC. Algunas condiciones y concentraciones de reactivos enumeradas pueden variar según la proteína de elección. Prepare todas las soluciones de reactivos en tubos microcentrífugos de 1,5 mL. Preparar una solución proteica de la concentración deseada, generalmente en el rango de decenas de μM, en un tampón de ácido 3-(N-morfolino)p…

Representative Results

Identificación de sitios de modificación de DEPC y porcentajes de modificaciónLa adición de masa debida al etiquetado covalente puede medirse en los niveles (a) de proteínas intactas y (b)péptidos 8,9. A nivel intacto, se puede obtener una distribución de especies de proteínas con diferentes números de etiquetas a partir del análisis directo o LC-MS de muestras de proteínas etiquetadas. Para obtener información estructural de mayor resolu…

Discussion

Pasos críticos
Se deben considerar varios puntos relacionados con el diseño experimental para garantizar resultados de etiquetado confiables. En primer lugar, para maximizar el etiquetado de proteínas, es necesario evitar los tampones con grupos fuertemente nucleófilos (por ejemplo, Tris) porque pueden reaccionar con DEPC y reducir el alcance del etiquetado. También es concebible que tales tampones puedan reaccionar con residuos etiquetados, causando la eliminación de la etiqueta y, por lo tanto, la pé…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Millipore Sigma	M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt	Millipore Sigma	M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column	Thermo Scientific	164537	300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-1
Diethylpyrocarbonate	Millipore Sigma	D5758
HPLC-grade water	Fisher Scientific	W5-1
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
Immobilized chymotrypsin	ProteoChem	g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated	Thermo Fisher Scientific	20230
Iodoacetamide	Millipore Sigma	I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine	Millipore Sigma	C4706