बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ डाइथिलपाइरोकार्बोनेट आधारित सहसंयोजक लेबलिंग करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। डायथिलपिरोकार्बोनेट को बस प्रोटीन या प्रोटीन कॉम्प्लेक्स ऑफ इंटरेस्ट के साथ मिलाया जाता है, जिससे सॉल्वेंट सुलभ अमीनो एसिड अवशेषों में संशोधन होता है। प्रोटियोलिटिक पाचन और तरल क्रोमेटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद संशोधित अवशेषों की पहचान की जा सकती है ।
प्रोटीन की उच्च क्रम संरचना की विशेषता इसके कार्य को समझने के लिए आवश्यक है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) इस उद्देश्य के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है, विशेष रूप से प्रोटीन सिस्टम के लिए जो पारंपरिक तरीकों से अध्ययन करना मुश्किल है। एमएस द्वारा प्रोटीन की संरचना का अध्ययन करने के लिए, विशिष्ट रासायनिक प्रतिक्रियाएं समाधान में की जाती हैं जो प्रोटीन की संरचनात्मक जानकारी को अपने द्रव्यमान में एन्कोड करती हैं। एक विशेष रूप से प्रभावी दृष्टिकोण अभिकर्मकों का उपयोग करना है जो सॉल्वेंट सुलभ अमीनो एसिड साइड चेन को सहसंयोजक रूप से संशोधित करते हैं। इन प्रतिक्रियाओं से बड़े पैमाने पर वृद्धि होती है जिसे प्रोटियोलिटिक पाचन और मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त होने पर अवशेष स्तर के संकल्प के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता है। यहां, हम एमएस डिटेक्शन के साथ मिलकर एक सहसंयोजक लेबलिंग रीएजेंट के रूप में डायथाइलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) के उपयोग से जुड़े प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। डीईपीसी एक अत्यधिक इलेक्ट्रोफिलिक अणु है जो औसत प्रोटीन में अवशेषों के 30% तक लेबलिंग करने में सक्षम है, जिससे उत्कृष्ट संरचनात्मक संकल्प प्रदान किया जाता है। डीईपीसी का उपयोग एमएस के साथ मिलकर एक-बड़े बहु-डोमेन प्रोटीन जैसे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जैसे छोटे एकल-डोमेन प्रोटीन, जैसे 2-माइक्रोग्लोबुलिन के लिए संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।
प्रोटीन लगभग हर शारीरिक प्रक्रिया में आवश्यक जैव अणु हैं। प्रोटीन प्रदर्शन करने वाले कार्यों की विविधता उनके द्वारा अपनाए जाने वाली संरचनाओं और अन्य जैव अणुओं के साथ होने वाली बातचीत के कारण संभव है। प्रोटीन फ़ंक्शन को गहरे स्तर पर समझने के लिए, इन महत्वपूर्ण संरचनात्मक विशेषताओं और बातचीत को स्पष्ट करने के लिए जैव रासायनिक और जैव भौतिक उपकरणों की आवश्यकता होती है। परंपरागत रूप से, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी ने प्रोटीन संरचना को प्रकट करने के लिए वांछित परमाणु स्तर का विस्तार प्रदान किया है। हालांकि, खराब क्रिस्टलीकरण व्यवहार, सीमित प्रोटीन उपलब्धता, अत्यधिक नमूना विषमता, या आणविक वजन सीमाओं के कारण इन तकनीकों द्वारा कई प्रोटीन प्रणालियों से पूछताछ नहीं की जा सकती है। नतीजतन, नए विश्लेषण तरीके उभरे हैं जो इन सीमाओं को दूर करते हैं। उभरती तकनीकों में से जो प्रोटीन संरचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री है।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) एक अणु के मास-टू-चार्ज (एम/जेड) अनुपात को मापता है, इसलिए प्रोटीन के द्रव्यमान में वांछित संरचनात्मक जानकारी को एन्कोडिंग करके प्रोटीन उच्च-क्रम संरचनात्मक जानकारी प्राप्त की जानी चाहिए। इस जानकारी को एन्कोड करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, जिनमें हाइड्रोजन-ड्यूटेरियमएक्सचेंज (एचडीएक्स)1,2,3,4,रासायनिक क्रॉसलिंकिंग (एक्सएल)5,6,और सहसंयोजक लेबलिंग (सीएल)7,8,9,10शामिल हैं। एचडीएक्स में, रीढ़ की हड्डी के अमेद हाइड्रोजन को दरों पर थोड़ा अधिक बड़े पैमाने पर ड्यूटेरियम द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है जो विलायक पहुंच और एच-बॉन्डिंग सीमा पर निर्भर करता है। एचडीएक्स की सीमा को प्रोटीन को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा इन टुकड़ों को अलग करने और मापने से पहले पेप्टाइड टुकड़ों में तेजी से पचाने या ऊपर-नीचे प्रयोग में प्रोटीन को अलग करके स्थानीयकृत किया जा सकता है। विनिमय की दर का निर्धारण प्रोटीन गतिशीलता में और अधिक जानकारी प्रदान करता है। एचडीएक्स बैक एक्सचेंज से जुड़ी चुनौतियों और प्रजनन क्षमता को अधिकतम करने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बावजूद प्रोटीन संरचना की विशेषता के लिए एक मूल्यवान उपकरण साबित हुआ है। एक्सएल-एमएस में, प्रोटीन को द्वि-कार्यात्मक अभिकर्मकों के साथ प्रतिक्रिया दी जाती है जो किसी दिए गए प्रोटीन के भीतर या दो प्रोटीन के बीच आसन्न अवशेष पक्ष श्रृंखलाओं को सहसंयोजक रूप से जोड़ते हैं। ऐसा करने में, एक्सएल-एमएस दूरी की बाधाएं प्रदान कर सकता है जिसका उपयोग प्रोटीन संरचना की विशेषता के लिए किया जा सकता है। प्रोटीन के क्षेत्र जो क्रॉस-लिंक्ड होते हैं, उनकी पहचान प्रोटियोलिटिक पाचन द्वारा की जा सकती है जिसके बाद तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) -एमएस विश्लेषण किया जाता है। जबकि एक्सएल-एमएस एक बहुमुखी उपकरण है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिसमें अंदर की कोशिकाएं शामिल हैं, एक्सएल उत्पादों की पहचान चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए विशेष सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है।
सीएल-एमएस हाल ही में प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक पूरक और कभी-कभी वैकल्पिक एमएस-आधारित उपकरण के रूप में उभरा है। सीएल-एमएस में, एक प्रोटीन या प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को मोनो-फंक्शनल रिएजेंट के साथ सहसंबद्ध रूप से संशोधित किया जाता है जो सॉल्वेंट-एक्सपोज्ड साइड चेन(चित्रा 1)के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है। विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन या प्रोटीन परिसर की संशोधन सीमा की तुलना करके, संरचना परिवर्तन, बाध्यकारी साइटों, और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरफेस से पता चला जा सकता है। सीएल प्रतिक्रिया के बाद, साइट-विशिष्ट जानकारी, अक्सर एकल अमीनो-एसिड स्तर पर, विशिष्ट बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है जिसमें प्रोटीन प्रोटेओलिटिकल रूप से पचाए जाते हैं, पेप्टाइड टुकड़े एलसी द्वारा अलग किए जाते हैं, और संशोधित साइटों को मिलकर एमएस (एमएस/एमएस) का उपयोग करके पहचाना जाता है। बायोकोन्जुगेट रसायन शास्त्र के समृद्ध इतिहास ने सीएल-एमएस प्रयोगों के लिए कई अभिकर् तार उपलब्ध कराए हैं। सीएल रिएजेंट दो सामान्य श्रेणियों में आते हैं: (i) विशिष्ट और (ii) गैर-विशिष्ट। विशिष्ट अभिकर्दक एक कार्यात्मक समूह (जैसे, मुफ्त अमीन)8,10 के साथ प्रतिक्रिया करते हैं और लागू करने में आसान होते हैं, लेकिन वे सीमित संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। गैर-विशिष्ट अभिकर्दक साइड चेन की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, लेकिन अक्सर इन अत्यधिक प्रतिक्रियाशील प्रजातियों का उत्पादन करने के लिए लेजर या सिंक्रोट्रॉन स्रोतों जैसे विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले गैर-विशिष्ट अभिकर्मक हैं, जो विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए हाइड्रोक्सिल रेडिकल फुटप्रिंटिंग (एचआरएफ)7,11,12,13 प्रयोगों में लागू किए गए हैं।
हमारे शोध समूह ने सीएल-एमएस प्रयोगों14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,23,24, 25के संदर्भ में प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए डायथाइलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) नामक एक और अपेक्षाकृत गैर-विशिष्ट अभिवाक का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। डीईपीसी विशिष्ट लेबलिंग अभिकर् ती की सादगी प्रदान करता है (यानी, प्रतिक्रियाओं को करने के लिए कोई विशेष उपकरण आवश्यक नहीं है), जबकि औसत प्रोटीन में 30% अमीनो एसिड के साथ प्रतिक्रिया करता है। एक अत्यधिक इलेक्ट्रोफिलिक रिएजेंट के रूप में, डीईपीसी एन-टर्मिनस और सिस्टीन, हिस्टिडीन, लिसाइन, टायरोसिन, सेरीन और थ्रेओनिन अवशेषों की न्यूक्लियोफिलिक साइड चेन के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम है। आमतौर पर, इन प्रतिक्रियाओं का एक भी उत्पाद उत्पन्न होता है, जिसके परिणामस्वरूप 72.02 डीए की बड़े पैमाने पर वृद्धि होती है। यह एक प्रकार का उत्पाद 55 तक विभिन्न उत्पादों के विपरीत है, जिनका उत्पादन तब किया जा सकता है जब प्रोटीन हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स7के साथ प्रतिक्रिया करता है। इस तरह के सरल रसायन चिह्नित साइटों की पहचान की सुविधा प्रदान करता है।
यहां, हम प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए डीईपीसी-आधारित सीएल-एमएस का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। अभिकर्षक तैयारी, डीईपीसी-प्रोटीन प्रतिक्रियाओं, प्रोटीन पाचन की स्थिति, एलसी-एमएस और एमएस/एमएस मापदंडों और डेटा विश्लेषण से जुड़े विवरणों का वर्णन किया गया है । हम प्रोटीन-धातु, प्रोटीन-लिगांड, और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के साथ-साथ हीटिंग पर संरचनात्मक परिवर्तनों के दौर से गुजर रहे प्रोटीन से उदाहरण परिणाम प्रदान करके डीईपीसी लेबलिंग की उपयोगिता को भी प्रदर्शित करते हैं।
महत्वपूर्ण कदम
विश्वसनीय लेबलिंग परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन के बारे में कई बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, प्रोटीन लेबलिंग को अधिकतम करने के लिए, दृढ़ता से न्यू…
The authors have nothing to disclose.
लेखक अनुदान R01 GM075092 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH) से समर्थन स्वीकार करते हैं । यहां वर्णित कुछ डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले थर्मो ऑर्बिटरप फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमीटर को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान S10OD010645 से धन के साथ अधिग्रहीत किया गया था।
1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |