Elektroporationsbasierte genetische Veränderung von primären menschlichen Pigmentepithelzellen mit dem Dornröschen-Transposon-System

Summary

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um primäre menschliche Pigmentepithelzellen durch Elektroporation mit dem Gen, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, unter Verwendung des Sleeping Beauty (SB) Transposon-Systems zu transfizieren. Die erfolgreiche Transfektion wurde durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Immunoblotting und enzymgebundenen Immunassay (ELISA) nachgewiesen.

Abstract

Unsere zunehmend alternde Gesellschaft führt zu einer zunehmenden Inzidenz neurodegenerativer Erkrankungen. Bisher sind die pathologischen Mechanismen nur unzureichend verstanden, was die Etablierung definierter Therapien erschwert. Zellbasierte additive Gentherapien zur erhöhten Expression eines Schutzfaktors gelten als vielversprechende Option zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD). Wir haben eine Methode zur stabilen Expression des Gens entwickelt, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, der als neuroprotektives und antiangiogenes Protein im Nervensystem charakterisiert wird, in das Genom primärer humaner Pigmentepithelzellen (PE) unter Verwendung des Dornröschen-Transposon-Systems. Primäre PE-Zellen wurden aus menschlichen Spenderaugen isoliert und in Kultur gehalten. Nach Erreichen des Zusammenflusses wurden 1 x 10⁴ Zellen in 11 μL Resuspensionspuffer suspendiert und mit 2 μL einer gereinigten Lösung kombiniert, die 30 ng hyperaktives SB (SB100X) Transposase-Plasmid und 470 ng PEDF-Transposon-Plasmid enthielt. Die genetische Veränderung erfolgte mit einem Kapillarelektroporationssystem unter Verwendung folgender Parameter: zwei Impulse mit einer Spannung von 1.100 V und einer Breite von 20 ms. Transfizierte Zellen wurden in Kulturplatten überführt, die ein mit fetalem Rinderserum ergänztes Medium enthielten; Antibiotika und Antimykotika wurden mit dem ersten Medienaustausch hinzugefügt. Die erfolgreiche Transfektion wurde in unabhängig durchgeführten Experimenten nachgewiesen. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zeigte die erhöhte Expression des PEDF-Transgens. Die PEDF-Sekretion war signifikant erhöht und blieb stabil, wie durch Immunoblotting bewertet und durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) quantifiziert. Der SB100X-vermittelte Transfer ermöglichte eine stabile PEDF-Genintegration in das Genom von PE-Zellen und stellte die kontinuierliche Sekretion von PEDF sicher, was für die Entwicklung einer zellbasierten Genadditionstherapie zur Behandlung von AMD oder anderen degenerativen Netzhauterkrankungen entscheidend ist. Darüber hinaus zeigte die Analyse des Integrationsprofils des PEDF-Transposons in menschliche PE-Zellen eine fast zufällige genomische Verteilung.

Introduction

Das fortgeschrittene Alter wird als Hauptrisiko für neurodegenerative Erkrankungen beschrieben. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), eine polygene Erkrankung, die bei Patienten über 60 Jahren zu schwerem Sehverlust führt, gehört zu den vier häufigsten Ursachen für Erblindung und Sehbehinderung¹ und wird voraussichtlich bis 2040 auf 288 Millionen Menschen ansteigen². Funktionsstörungen des retinalen Pigmentepithels (RPE), einer einzigen Schicht dicht gepackter Zellen zwischen der Choriokapillare und den retinalen Photorezeptoren, tragen zur Pathogenese der AMD bei. Das RPE erfüllt mehrere Aufgaben, die für eine normale Netzhautfunktion unerlässlich sind³ und sondert eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Faktoren ab, die für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Netzhaut und der Choriokapillaris unerlässlich sind, wodurch das Überleben der Photorezeptoren unterstützt und eine Grundlage für die Zirkulation und die Versorgung mit Nährstoffen geschaffen wird.

In gesunden Augen ist der Pigmentepithel-abgeleitete Faktor (PEDF) dafür verantwortlich, die Auswirkungen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) auszugleichen und Neuronen vor Apoptose zu schützen, die Proliferation von Endothelzellen zu verhindern und das kapillare Endothel zu stabilisieren. Ein verschobenes VEGF-zu-PEDF-Verhältnis hängt mit der okulären Neovaskularisation zusammen, die in Tiermodellen^4,5 sowie in Proben von Patienten mit choroidaler Neovaskularisation (CNV) aufgrund von AMD und proliferativer diabetischer Retinopathie beobachtet wurde 6,7,8,9,10 . Die erhöhte VEGF-Konzentration ist das Ziel für die aktuelle Standardbehandlung. Die Anti-VEGF-Medikamente Bevacizumab, Ranibizumab, Aflibercept und neuerdings Brolucizumab verbessern bei etwa einem Drittel der CNV-Patienten die Sehschärfe bzw. stabilisieren das Sehvermögen in 90% der Fälle^11,12,13. Die häufigen, oft monatlichen intravitrealen Injektionen bergen jedoch das Risiko unerwünschter Ereignisse¹⁴, beeinträchtigen die Compliance der Patienten und stellen eine erhebliche wirtschaftliche Belastung für die Gesundheitssysteme dar¹⁵. Darüber hinaus spricht ein gewisser Prozentsatz der Patienten (2%-20%) nicht oder nur schlecht auf die Anti-VEGF-Therapie^{an 16,17,18,19}. Diese negativen Begleiterscheinungen erfordern die Entwicklung alternativer Therapien, z.B. intraokularer Implantate, zell- und/oder gentherapeutischer Ansätze.

Die Gentherapie hat sich zu einer vielversprechenden Behandlung für erbliche und nicht-erbliche Krankheiten entwickelt und zielt darauf ab, nicht funktionsfähige Gensequenzen wiederherzustellen oder Fehlfunktionen zu unterdrücken. Bei polygenen Erkrankungen, bei denen die Identifizierung und der Ersatz der ursächlichen Faktoren kaum möglich ist, zielen Strategien auf die kontinuierliche Bereitstellung eines Schutzfaktors ab. Im Fall der AMD wurden verschiedene additive Therapien entwickelt, wie die stabile Expression von Endostatin und Angiostatin 20, der VEGF-Antagonist lösliche fms-ähnliche Tyrosinkinase-1 (sFLT-1)21,22, der komplementregulatorische Proteincluster der Differenzierung 59 (CD59)²³ oder PEDF ^24,25 . Das Auge und insbesondere die Netzhaut sind aufgrund der geschlossenen Struktur, der guten Zugänglichkeit, der geringen Größe und des Immunprivilegs ein ausgezeichnetes Ziel für eine genbasierte Medikation, wodurch eine lokalisierte Abgabe niedriger therapeutischer Dosen ermöglicht wird und Transplantate weniger anfällig für Abstoßungen werden. Darüber hinaus ermöglicht das Auge eine nicht-invasive Überwachung und die Netzhaut kann mit verschiedenen bildgebenden Verfahren untersucht werden.

Virale Vektoren sind aufgrund ihrer hohen Transduktionseffizienz das Hauptvehikel, um therapeutische Gene in Zielzellen zu bringen. Je nach verwendetem viralen Vektor wurden jedoch unterschiedliche Nebenwirkungen beschrieben, wie Immun- und Entzündungsreaktionen²⁶, mutagene und onkogene Wirkungen ^27,28 oder Verbreitung in anderen Geweben²⁹. Zu den praktischen Einschränkungen gehören eine begrenzte Verpackungsgröße³⁰ sowie Schwierigkeiten und Kosten im Zusammenhang mit der Herstellung von klinischen Chargen^31,32. Diese Nachteile haben die Weiterentwicklung nicht-viraler, plasmidbasierter Vektoren gefördert, die über Lipo-/Polyplexe, Ultraschall oder Elektroporation übertragen werden. Die genomische Integration des Transgens in das Wirtsgenom wird jedoch in der Regel nicht mit Plasmidvektoren gefördert, was zu einer vorübergehenden Expression führt.

Transposons sind natürlich vorkommende DNA-Fragmente, die ihre Position innerhalb des Genoms ändern, eine Eigenschaft, die für die Gentherapie übernommen wurde. Aufgrund eines aktiven Integrationsmechanismus ermöglichen transposonbasierte Vektorsysteme eine kontinuierliche und konstante Expression des eingefügten Transgens. Das Dornröschen-Transposon (SB), rekonstituiert aus einem alten Transposon vom Typ Tc1/Mariner, das in Fisch³³ gefunden und durch molekulare Evolution weiter verbessert wurde, was zur hyperaktiven Variante SB100X³⁴ führte, ermöglichte eine effiziente Transposition in verschiedenen Primärzellen und wurde für die phänotypische Korrektur in verschiedenen Krankheitsmodellen^{verwendet 35}. Derzeit wurden 13 klinische Studien mit dem SB-Transposon-System gestartet. Das SB100X-Transposon-System besteht aus zwei Komponenten: dem Transposon, das das interessierende Gen umfasst, flankiert von terminalen invertierten Wiederholungen (TIR), und der Transposase, die das Transposon mobilisiert. Nach der Lieferung von Plasmid-DNA an die Zellen bindet die Transposase die TIRs und katalysiert die Exzision und Integration des Transposons in das Genom der Zelle.

Wir haben eine nicht-virale zellbasierte additive Therapie zur Behandlung der neovaskulären AMD entwickelt. Der Ansatz umfasst die elektroporationsbasierte Insertion des PEDF-Gens in primäre Pigmentepithelzellen (PE) mittels des SB100X-Transposonsystems ^36,37,38. Die genetische Information von Transposase und PEDF wird auf separaten Plasmiden bereitgestellt, wodurch die Einstellung des idealen SB100X-zu-PEDF-Transposon-Verhältnisses ermöglicht wird. Die Elektroporation wird mit einem pipettenbasierten Kapillartransfektionssystem durchgeführt, das sich durch eine maximale Spaltgröße zwischen den Elektroden bei gleichzeitiger Minimierung ihrer Oberfläche auszeichnet. Es wurde gezeigt, dass das Gerät hervorragende Transfektionsraten in einem breiten Spektrum von Säugetierzellen^erreicht 39,40,41. Die kleine Elektrodenoberfläche sorgt für ein gleichmäßiges elektrisches Feld und reduziert die verschiedenen Nebenwirkungen der Elektrolyse⁴².

Die antiangiogene Funktionalität von PEDF, das von transfizierten Pigmentepithelzellen sezerniert wird, wurde in verschiedenen In-vitro-Experimenten gezeigt, in denen das Keimen, die Migration und die Apoptose menschlicher Nabelvenendothelzellen analysiert^{wurden 43}. Darüber hinaus zeigte die Transplantation von PEDF-transfizierten Zellen in einem Kaninchenmodell der Hornhautneovaskularisation⁴⁴ sowie einem Rattenmodell von CNV^43,45,46 einen Rückgang der Neovaskularisation.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die stabile Insertion des PEDF-Gens in primäre menschliche RPE-Zellen über das SB100X-Transposonsystem unter Verwendung eines Kapillartransfektionssystems. Die transfizierten Zellen wurden 21 Tage in Kultur gehalten und anschließend hinsichtlich der PEDF-Genexpression durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und hinsichtlich der PEDF-Proteinsekretion durch Immunoblotting und enzymgebundenen Immunassay analysiert (ELISA, Abbildung 1).

Protocol

Humane Spenderaugen wurden von der Aachener Hornhautbank der Augenklinik (Universitätsklinikum RWTH Aachen) nach Einholung der Einverständniserklärung gemäß den Protokollen der Deklaration von Helsinki bezogen. Die Verfahren für die Entnahme und Verwendung von Humanproben wurden von der institutionellen Ethikkommission genehmigt. 1. Isolierung primärer humaner RPE-Zellen Legen Sie sterile Schutzkleidung und Handschuhe aus. Legen Sie einen sterilen Vorhang unter eine laminare S…

Representative Results

Kultivierung und Elektroporation primärer humaner RPE-ZellenWir haben gezeigt, dass die Aussaat einer ausreichenden Anzahl von primären RPE-Zellen tierischen Ursprungs die Kultivierung und das Wachstum zu einer integrierten Monoschicht pigmentierter, hexagonal geformter Zellenermöglicht 36,37,48. Ihre Fähigkeit, Tight Junctions zu bilden, phagozytische Aktivität zu zeige…

Discussion

In unserem Projekt streben wir die nicht-virale Produktion von gentechnisch veränderten primären humanen RPE-Zellen an, die kontinuierlich einen wirksamen Faktor überexprimieren und sezernieren, um die transfizierten Zellen als Langzeittherapeutikum für die Etablierung und Aufrechterhaltung einer schützenden Umgebung zu nutzen. Wir haben die Einführung des Gens etabliert, das für PEDF kodiert, ein ubiquitär exprimiertes multifunktionales Protein mit antiangiogenen und neuroprotektiven Funktionen. Das hier beschri…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054