Modificazione genetica basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco

Summary

Abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare le cellule epiteliali pigmentate umane primarie mediante elettroporazione con il gene che codifica il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Il successo della trasfezione è stato dimostrato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), immunoblotting e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Abstract

La nostra società sempre più anziana porta a una crescente incidenza di malattie neurodegenerative. Finora, i meccanismi patologici non sono adeguatamente compresi, impedendo così l’istituzione di trattamenti definiti. Le terapie geniche additive basate sulle cellule per l’aumentata espressione di un fattore protettivo sono considerate un’opzione promettente per medicare le malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all’età (AMD). Abbiamo sviluppato un metodo per l’espressione stabile del gene che codifica per il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF), che è caratterizzato come una proteina neuroprotettiva e anti-angiogenica nel sistema nervoso, nel genoma delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie (PE) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Le cellule PE primarie sono state isolate dagli occhi dei donatori umani e mantenute in coltura. Dopo aver raggiunto la confluenza, 1 x 10⁴ cellule sono state sospese in 11 μL di tampone di risospensione e combinate con 2 μL di una soluzione purificata contenente 30 ng di plasmide iperattivo SB (SB100X) trasposasi e 470 ng di plasmide trasposone PEDF . La modificazione genetica è stata effettuata con un sistema di elettroporazione capillare utilizzando i seguenti parametri: due impulsi con una tensione di 1.100 V e una larghezza di 20 ms. Le cellule trasfettate sono state trasferite in piastre di coltura contenenti terreno integrato con siero fetale bovino; Antibiotici e antimicotici sono stati aggiunti con il primo scambio di mezzo. La trasfezione di successo è stata dimostrata in esperimenti eseguiti in modo indipendente. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) ha mostrato l’aumentata espressione del transgene PEDF . La secrezione di PEDF era significativamente elevata e rimaneva stabile, come valutato mediante immunoblotting e quantificato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Il trasferimento mediato da SB100X ha permesso un’integrazione stabile del gene PEDF nel genoma delle cellule PE e ha assicurato la secrezione continua di PEDF, che è fondamentale per lo sviluppo di una terapia di aggiunta genica basata su cellule per il trattamento di AMD o altre malattie degenerative della retina. Inoltre, l’analisi del profilo di integrazione del trasposone PEDF in cellule PE umane ha indicato una distribuzione genomica quasi casuale.

Introduction

L’età avanzata è descritta come il principale rischio di malattie neurodegenerative. La degenerazione maculare legata all’età (AMD), una malattia poligenica che porta a una grave perdita della vista nei pazienti di età superiore ai 60 anni, appartiene alle quattro cause più comuni di cecità e compromissione della vista¹ e si prevede che aumenterà a 288 milioni di persone nel 2040². Le disfunzioni dell’epitelio pigmentato retinico (RPE), un singolo strato di cellule strettamente impacchettate situate tra il coriocapillare e i fotorecettori retinici, contribuiscono alla patogenesi dell’AMD. L’RPE svolge molteplici compiti essenziali per una normale funzione retinica³ e secerne una varietà di fattori di crescita e fattori essenziali per mantenere l’integrità strutturale della retina e del coriocapillare, supportando così la sopravvivenza dei fotorecettori e fornendo una base per la circolazione e l’apporto di nutrienti.

Negli occhi sani, il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF) è responsabile del bilanciamento degli effetti del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e protegge i neuroni dall’apoptosi, previene la proliferazione delle cellule endoteliali e stabilizza l’endotelio capillare. Uno spostamento del rapporto VEGF-PEDF è correlato alla neovascolarizzazione oculare, che è stata osservata nei modelli animali^4,5 e in campioni di pazienti con neovascolarizzazione coroideale (CNV) dovuta a AMD e retinopatia diabetica proliferativa 6,7,8,9,10 . L’aumento della concentrazione di VEGF è l’obiettivo per l’attuale trattamento standard. I farmaci anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept e, più recentemente, brolucizumab migliorano l’acuità visiva in circa un terzo dei pazienti con CNV o meglio stabilizzano la vista nel 90% dei casi^11,12,13. Tuttavia, le frequenti iniezioni intravitreali, spesso mensili, comportano il rischio di eventi avversi¹⁴, compromettono la compliance del paziente e rappresentano un onere economico significativo per i sistemi sanitari¹⁵. Inoltre, una certa percentuale di pazienti (2%-20%) non risponde o reagisce solo male alla terapia anti-VEGF^16,17,18,19. Questi concomitanti negativi richiedono lo sviluppo di trattamenti alternativi, ad esempio impianti intraoculari, approcci terapeutici cellulari e/o genici.

La terapia genica si è evoluta come trattamento promettente per le malattie ereditarie e non ereditarie e intende ripristinare sequenze geniche non funzionali o sopprimere quelle malfunzionanti. Per le malattie poligeniche, dove l’identificazione e la sostituzione dei fattori causali è difficilmente possibile, le strategie mirano alla fornitura continua di un fattore protettivo. Nel caso dell’AMD, sono state sviluppate varie terapie additive, come l’espressione stabile di endostatina e angiostatina²⁰, l’antagonista VEGF tirosin-simile alla tirosin-chinasi-1 (sFLT-1)21,22, il cluster proteico regolatore del complemento della differenziazione 59 (CD59)23 o PEDF ^24,25 . L’occhio, e in particolare la retina, è un bersaglio eccellente per un farmaco basato su geni a causa della struttura chiusa, della buona accessibilità, delle piccole dimensioni e del privilegio immunitario, consentendo così una consegna localizzata di basse dosi terapeutiche e rendendo i trapianti meno suscettibili al rigetto. Inoltre, l’occhio consente un monitoraggio non invasivo e la retina può essere esaminata con diverse tecniche di imaging.

I vettori virali sono, a causa della loro elevata efficienza di trasduzione, il veicolo principale per fornire geni terapeutici nelle cellule bersaglio. Tuttavia, a seconda del vettore virale utilizzato, sono state descritte diverse reazioni avverse, come risposte immunitarie e infiammatorie²⁶, effetti mutageni e oncogeni ^27,28 o disseminazione in altri tessuti²⁹. Le limitazioni pratiche includono una dimensione di imballaggio limitata³⁰, nonché difficoltà e costi associati alla produzione di lotti di grado clinico^31,32. Questi inconvenienti hanno promosso l’ulteriore sviluppo di vettori non virali basati su plasmidi che vengono trasferiti tramite lipo / poliplex, ultrasuoni o elettroporazione. Tuttavia, l’integrazione genomica del transgene nel genoma dell’ospite di solito non è promossa con vettori plasmidici, risultando così in un’espressione transitoria.

I trasposoni sono frammenti di DNA presenti in natura che cambiano la loro posizione all’interno del genoma, una caratteristica che è stata adottata per la terapia genica. Grazie ad un meccanismo di integrazione attivo, i sistemi vettoriali basati su trasposoni consentono un’espressione continua e costante del transgene inserito. Il trasposone della Bella Addormentata (SB), ricostituito da un antico trasposone di tipo Tc1/marinaio trovato nel pesce³³ e ulteriormente migliorato dall’evoluzione molecolare risultante nella variante iperattiva SB100X³⁴, ha permesso una trasposizione efficiente in varie cellule primarie ed è stato utilizzato per la correzione fenotipica in diversi modelli di malattia³⁵. Attualmente, 13 studi clinici sono stati avviati utilizzando il sistema di trasposone SB. Il sistema di trasposone SB100X è costituito da due componenti: il trasposone, che comprende il gene di interesse affiancato da ripetizioni invertite terminali (TIR), e la trasposasi, che mobilizza il trasposone. Dopo la consegna del DNA plasmidico alle cellule, la trasposasi lega i TIR e catalizza l’escissione e l’integrazione del trasposone nel genoma della cellula.

Abbiamo sviluppato una terapia additiva non virale basata su cellule per il trattamento dell’AMD neovascolare. L’approccio comprende l’inserimento basato sull’elettroporazione del gene PEDF in cellule epiteliali pigmentate primarie (PE) mediante il sistema di trasposone SB100X ^36,37,38. Le informazioni genetiche della trasposasi e del PEDF sono fornite su plasmidi separati, consentendo così la regolazione del rapporto ideale tra trasposone SB100X e PEDF. L’elettroporazione viene eseguita utilizzando un sistema di trasfezione capillare basato su pipette caratterizzato da una dimensione massima dello spazio tra gli elettrodi, riducendo al minimo la loro superficie. Il dispositivo ha dimostrato di raggiungere eccellenti tassi di trasfezione in una vasta gamma di cellule di mammifero 39,40,41. La piccola superficie dell’elettrodo fornisce un campo elettrico uniforme e riduce i vari effetti collaterali dell’elettrolisi⁴².

La funzionalità anti-angiogenica del PEDF secreta dalle cellule epiteliali pigmentate trasfettate è stata dimostrata in vari esperimenti in vitro analizzando la germinazione, la migrazione e l’apoptosi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana⁴³. Inoltre, il trapianto di cellule trasfettate con PEDF in un modello di coniglio di neovascolarizzazione corneale⁴⁴ e in un modello di ratto di CNV^43,45,46 ha mostrato un declino della neovascolarizzazione.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l’inserimento stabile del gene PEDF in cellule RPE umane primarie tramite il sistema di trasposone SB100X utilizzando un sistema di trasfezione capillare. Le cellule trasfettate sono state tenute in coltura per 21 giorni e successivamente analizzate in termini di espressione genica PEDF mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) e in termini di secrezione proteica PEDF mediante immunoblotting e saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA, Figura 1).

Protocol

Gli occhi dei donatori umani sono stati ottenuti dalla Banca della cornea di Aquisgrana del Dipartimento di Oftalmologia (Ospedale universitario RWTH di Aquisgrana) dopo aver ottenuto il consenso informato in conformità con i protocolli della Dichiarazione di Helsinki. Le procedure per la raccolta e l’uso di campioni umani sono state approvate dal comitato etico istituzionale. 1. Isolamento di cellule RPE umane primarie Stendere indumenti protettivi sterili e guanti. Posizionare un …

Representative Results

Coltivazione ed elettroporazione di cellule RPE umane primarieAbbiamo dimostrato che la semina di un numero sufficiente di cellule RPE primarie di origine animale consente la coltivazione e la crescita in un monostrato integrato di cellule pigmentate di forma esagonale36,37,48. La loro capacità di formare giunzioni strette, di esibire attività fagocitaria e di esprimere gen…

Discussion

Nel nostro progetto, miriamo alla produzione non virale di cellule RPE umane primarie geneticamente modificate che sovraesprimono continuamente e secernono un fattore efficace al fine di utilizzare le cellule trasfettate come terapia a lungo termine per la creazione e il mantenimento di un ambiente protettivo. Abbiamo stabilito l’introduzione del gene che codifica per il PEDF, una proteina multifunzionale ubiquitariamente espressa con funzioni anti-angiogeniche e neuroprotettive. Il protocollo qui descritto può essere u…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054