שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

Summary

פיתחנו פרוטוקול לטרנספקציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים על ידי אלקטרופורציה עם הגן המקודד גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). העברה מוצלחת הודגמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).

Abstract

החברה המזדקנת יותר ויותר שלנו מובילה לשכיחות גוברת של מחלות נוירודגנרטיביות. עד כה, המנגנונים הפתולוגיים אינם מובנים כראוי, ובכך מעכבים את כינונתם של טיפולים מוגדרים. טיפולים גנטיים מוספים מבוססי תאים לביטוי מוגבר של גורם מגן נחשבים כאופציה מבטיחה לטיפול תרופתי במחלות נוירודגנרטיביות, כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). פיתחנו שיטה לביטוי יציב של הגורם הנגזר מאפיתל פיגמנטי (PEDF), המאופיין כחלבון נוירו-פרוטקטיבי ואנטי-אנגיוגני במערכת העצבים, לתוך הגנום של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). תאי PE ראשוניים בודדו מעיני תורמים אנושיים ונשמרו בתרבית. לאחר שהגיעו למפגש, 1 x 10^{4 תאים} הושעו ב-11 μL של מאגר resuspension ובשילוב עם 2 μL של תמיסה מטוהרת המכילה 30 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזן היפראקטיבי (SB100X) ו-470 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזון PEDF. השינוי הגנטי בוצע עם מערכת אלקטרופורציה נימית באמצעות הפרמטרים הבאים: שתי פולסים עם מתח של 1,100 V ורוחב של 20 ms. תאים שעברו טרנספקציה הועברו לצלחות תרבית המכילות תוסף בינוני עם סרום בקר עוברי; אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה נוספו עם חילופי המדיום הראשונים. העברה מוצלחת הודגמה בניסויים שבוצעו באופן עצמאי. תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) הראתה את הביטוי המוגבר של טרנסגן PEDF. הפרשת ה-PEDF הייתה גבוהה באופן משמעותי ונותרה יציבה, כפי שהוערך על ידי אימונובלוטציה, וכומתה על ידי בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA). העברה בתיווך SB100X אפשרה אינטגרציה יציבה של גן PEDF בגנום של תאי PE והבטיחה הפרשה מתמשכת של PEDF, שהיא קריטית לפיתוח טיפול תוספת גנים מבוסס תאים לטיפול ב- AMD או במחלות ניווניות אחרות ברשתית. יתר על כן, ניתוח פרופיל האינטגרציה של טרנספוזון PEDF לתאי PE אנושיים הצביע על התפלגות גנומית כמעט אקראית.

Introduction

גיל מתקדם מתואר כסיכון העיקרי למחלות נוירודגנרטיביות. ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלה פוליגנית המובילה לאובדן ראייה חמור בחולים מעל גיל 60, שייך לארבעת הגורמים השכיחים ביותר לעיוורון ולפגיעה בראייה¹ וצפוי לעלות ל -288 מיליון איש בשנת 2040². תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), שכבה אחת של תאים ארוזים היטב הממוקם בין choriocapillaris לבין photoreceptors הרשתית, לתרום פתוגנזה של AMD. ה- RPE ממלא משימות מרובות החיוניות לתפקוד רשתית תקין³ ומפריש מגוון גורמי גדילה וגורמים חיוניים לשמירה על השלמות המבנית של הרשתית והכוריוקפילריס, ובכך תומך בהישרדות הפוטורצפטור ומספק בסיס למחזור הדם ולאספקת חומרים מזינים.

בעיניים בריאות, גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) אחראי לאיזון ההשפעות של גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) ומגן על תאי עצב מפני אפופטוזיס, מונע שגשוג תאי אנדותל ומייצב את האנדותל הנימי. יחס VEGF-to-PEDF קשור לניאו-וסקולריזציה של העין, אשר נצפתה במודלים של בעלי חיים ^4,5 וכן בדגימות של חולים עם ניאו-וסקולריזציה כורואידלית (CNV) עקב AMD ורטינופתיה סוכרתית שגשוג 6,7,8,9,10 . ריכוז ה-VEGF המשופר הוא היעד לטיפול הסטנדרטי הנוכחי. התרופות נגד VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ולאחרונה, brolucizumab לשפר את חדות הראייה בכשליש מחולי CNV או ליתר דיוק לייצב את הראייה ב 90% מהמקרים^11,12,13. עם זאת, הזריקות התוך-גופיות התכופות, לעתים קרובות חודשיות, נושאות בסיכון לתופעות לוואי¹⁴, פוגעות בציות המטופלים ומהוות נטל כלכלי משמעותי על מערכות הבריאות¹⁵. יתר על כן, אחוז מסוים מהחולים (2%-20%) אינם מגיבים או רק מגיבים בצורה גרועה לטיפול נגד VEGF^16,17,18,19. מקבילות שליליות אלה מחייבות פיתוח של טיפולים אלטרנטיביים, כגון שתלים תוך עיניים, גישות טיפוליות בתאים ו/או בגנים.

הריפוי הגנטי התפתח כטיפול מבטיח במחלות תורשתיות ולא תורשתיות ומתכוון לשחזר רצפי גנים לא מתפקדים או לדכא תקלות. עבור מחלות פוליגניות, שבהן זיהוי והחלפה של הגורמים הסיבתיים כמעט ואינו אפשרי, אסטרטגיות שואפות לאספקה רציפה של גורם מגן. במקרה של AMD, פותחו טיפולים מוספים שונים, כגון הביטוי היציב של אנדוסטטין ואנגיוסטטין 20, אנטגוניסט VEGF מסיס דמוי טירוזין קינאז-1 (sFLT-1)21,22, אשכול החלבון הרגולטורי המשלים של התמיינות 59 (CD59)²³ או PEDF ^24,25 . העין, ובמיוחד הרשתית, היא מטרה מצוינת לתרופה מבוססת גנים בשל המבנה הסגור, הנגישות הטובה, הגודל הקטן והפריבילגיה החיסונית, ובכך מאפשרת אספקה מקומית של מינונים טיפוליים נמוכים והופכת את ההשתלות לפחות רגישות לדחייה. יתר על כן, העין מאפשרת ניטור לא פולשני, וניתן לבחון את הרשתית בטכניקות הדמיה שונות.

וקטורים נגיפיים הם, בגלל יעילות ההתמרה הגבוהה שלהם, הכלי העיקרי להעברת גנים טיפוליים לתאי מטרה. עם זאת, בהתאם לווקטור הנגיפי המשמש, תוארו תגובות שליליות שונות, כגון תגובות חיסוניות ודלקתיות²⁶, השפעות מוטגניות ואונקוגניות^27,28, או הפצה ברקמות אחרות ²⁹. המגבלות המעשיות כוללות גודל אריזה מוגבל³⁰ וכן קשיים ועלויות הכרוכים בייצור מגרשים ברמה קלינית^31,32. חסרונות אלה קידמו את המשך הפיתוח של וקטורים לא ויראליים, מבוססי פלסמיד, המועברים באמצעות ליפו-/פוליפלקסים, אולטרסאונד או אלקטרופורציה. עם זאת, אינטגרציה גנומית של הטרנסגן לתוך הגנום המארח בדרך כלל אינה מקודמת עם וקטורים פלסמידים, וכתוצאה מכך ביטוי חולף.

טרנספוזונים הם מקטעי דנ”א טבעיים המשנים את מיקומם בתוך הגנום, מאפיין שאומץ לריפוי גנטי. בשל מנגנון אינטגרציה פעיל, מערכות וקטוריות מבוססות טרנספוזון מאפשרות ביטוי רציף וקבוע של הטרנסגן המוכנס. הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB), ששוחזר מטרנספוזון עתיק מסוג Tc1/mariner שנמצא בדגים³³ ושופר עוד יותר על ידי אבולוציה מולקולרית וכתוצאה מכך הגרסה ההיפראקטיבית SB100X³⁴, אפשרה טרנספוזיציה יעילה בתאים ראשוניים שונים ושימשה לתיקון פנוטיפי במודלים שונים של מחלות³⁵. נכון לעכשיו, 13 ניסויים קליניים החלו באמצעות מערכת טרנספוזון SB . מערכת הטרנספוזון SB100X מורכבת משני מרכיבים: הטרנספוזון, המרכיב את הגן המעניין המוקף בחזרות הפוכות סופניות (TIRs), והטרנספוזה, המגייסת את הטרנספוזון. לאחר העברת דנ”א פלסמיד לתאים, הטרנספוזאז קושר את ה-TIRs ומזרז את הכריתה והאינטגרציה של הטרנספוזון בגנום של התא.

פיתחנו תוסף שאינו מבוסס על תאים נגיפיים לטיפול ב- AMD ניאו-וסקולרי. הגישה כוללת החדרה מבוססת אלקטרופורציה של הגן PEDF לתאי אפיתל פיגמנטים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X ^36,37,38. המידע הגנטי של הטרנספוזאז וה-PEDF מסופק על פלסמידים נפרדים, ובכך מאפשר התאמה של יחס הטרנספוזון האידיאלי SB100X-to-PEDF. האלקטרופורציה מתבצעת באמצעות מערכת טרנספקציה נימית מבוססת פיפטה המאופיינת בגודל מרווח מקסימלי בין האלקטרודות תוך מזעור שטח הפנים שלהן. הודגם כי המכשיר משיג שיעורי העברה מצוינים במגוון רחב של תאי יונקים 39,40,41. שטח הפנים של האלקטרודה הקטנה מספק שדה חשמלי אחיד ומפחית את תופעות הלוואי השונות של אלקטרוליזה⁴².

הפונקציונליות האנטי-אנגיוגנית של PEDF המופרשת על ידי תאי אפיתל פיגמנטיים שעברו טרנספקציה הודגמה בניסויים שונים במבחנה שניתחו את ההנבטה, הנדידה והאפופטוזיס של תאי אנדותל וורידי הטבור האנושיים⁴³. בנוסף, השתלת תאים שעברו טרנספקציה של PEDF במודל ארנב של ניאו-וסקולריזציה של הקרנית⁴⁴ וכן מודל חולדות של^{CNV 43,45,46} הראו ירידה של ניאו-וסקולריזציה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להחדרה יציבה של הגן PEDF לתאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת טרנספוזון SB100X באמצעות מערכת טרנספקציה נימרית. התאים שעברו טרנספקציה נשמרו בתרבית במשך 21 יום ולאחר מכן נותחו במונחים של ביטוי גנים של PEDF על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ובמונחים של הפרשת חלבון PEDF על ידי אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA, איור 1).

Protocol

עיני התורם האנושי התקבלו מבנק אאכן קורניאה של המחלקה לרפואת עיניים (בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) לאחר קבלת הסכמה מדעת בהתאם לפרוטוקולי הצהרת הלסינקי. נהלים לאיסוף דגימות אנושיות ולשימוש בהן אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית. 1. בידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים פרשו ב?…

Representative Results

טיפוח ואלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשונייםהראינו כי זריעה של מספר מספיק של תאי RPE ראשוניים ממוצא מן החי מאפשרת טיפוח וצמיחה לחד-שכבתי משולב של תאים בעלי פיגמנטציה בצורת משושה36,37,48. יכולתם ליצור צמתים הדוק?…

Discussion

בפרויקט שלנו, אנו שואפים לייצור לא ויראלי של תאי RPE אנושיים ראשוניים מהונדסים גנטית, אשר מבטאים יתר על המידה ומפרישים ללא הרף גורם יעיל על מנת להשתמש בתאים המועתקים כטיפול ארוך טווח להקמה ותחזוקה של סביבה מגוננת. ביססנו את ההקדמה של הגן המקודד PEDF, חלבון רב-תפקודי המתבטא בכל מקום עם פונקציות…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054