Anwendung des RatWalker-Systems zur Ganganalyse in einem genetischen Rattenmodell der Parkinson-Krankheit
Summary
Hier beschreiben wir das RatWalker-System, das durch die Neugestaltung des MouseWalker-Geräts erstellt wurde, um der zunehmenden Größe und dem Gewicht von Ratten gerecht zu werden. Dieses System verwendet frustrierte Totalreflexion (FTIR), Hochgeschwindigkeits-Videoaufzeichnung und Open-Access-Analysesoftware, um Gangparameter zu verfolgen und zu quantifizieren.
Abstract
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die durch den Verlust von dopaminergen (DA) Neuronen in der Substantia nigra pars compacta verursacht wird. Ganganomalien, einschließlich verminderter Armschwingung, langsamerer Gehgeschwindigkeit und kürzerer Schritte, sind bei Parkinson-Patienten häufig und treten früh im Krankheitsverlauf auf. Daher wird die Quantifizierung von motorischen Mustern in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit für die phänotypische Charakterisierung während des Krankheitsverlaufs und bei der therapeutischen Behandlung wichtig sein. Die meisten Fälle von Parkinson sind idiopathisch; Die Identifizierung erblicher Formen der Parkinson-Krankheit deckte jedoch Genmutationen und -varianten auf, wie z. B. Funktionsverlust-Mutationen in Pink1 und Parkin, zwei Proteinen, die an der mitochondrialen Qualitätskontrolle beteiligt sind und zur Erstellung von Tiermodellen genutzt werden könnten. Während Mäuse bei Verlust von Pink1 und Parkin (einfache und kombinierte Deletion) resistent gegen Neurodegeneration sind, führt bei Ratten ein Pink1-Mangel, aber nicht ein Parkin-Mangel, zu einem nigralen DA-Neuronenverlust und einer motorischen Beeinträchtigung. Hier berichten wir über den Nutzen der FTIR-Bildgebung zur Aufdeckung von Gangveränderungen bei frei gehenden jungen (2 Monate alten) männlichen Ratten mit kombiniertem Verlust von Pink1 und Parkin vor der Entwicklung einer groben visuell sichtbaren motorischen Anomalie mit zunehmendem Alter dieser Ratten (beobachtet nach 4-6 Monaten), gekennzeichnet durch das Ziehen der Hinterbeine, wie zuvor bei Pink1 Knockout (KO) Ratten berichtet.
Introduction
Parkinson, die häufigste altersbedingte neurodegenerative Bewegungsstörung, wird durch den Verlust von DA-Neuronen in der Substantia nigra pars compacta verursacht. Dieser Verlust von nigralen DA-Neuronen und die DA-Einträge in das Striatum führen zu den beobachteten motorischen Funktionsbeeinträchtigungen, die bei Patienten mit PD 1,2 beobachtet wurden. Zu den charakteristischen motorischen Merkmalen von Patienten mit Parkinson, die zusammen als Parkinsonismus bezeichnet werden, gehören Rigidität, Ruhetremor, Bradykinesie, Haltungsinstabilität und Mikrographie3. Darüber hinaus treten Gangstörungen, die bei Parkinson-Patienten häufig sind, früh im Krankheitsverlaufauf 1,4,5. Während bestimmte Lebensstile vorgeschlagen werden, um das Fortschreiten der Parkinson-Krankheit zu verlangsamen, wie gesunde Ernährung und regelmäßige Bewegung, gibt es derzeit keine Heilung für Parkinson, nur Medikamente zur Behandlung der Symptome. Dies lässt Raum für die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen in der Hoffnung auf verbesserte Therapeutika. Daher ist die Charakterisierung des Gangmusters in Parkinson-Tiermodellen ein entscheidendes Werkzeug, um die Relevanz des Modells zu charakterisieren und zu bestimmen, wie therapeutische Behandlungen zur Kontrolle der Parkinson-Krankheit motorische Beeinträchtigungen verhindern oder verbessern.
Es gibt verschiedene PD-Tiermodelle, die verwendet wurden, um therapeutische Behandlungen zu testen, aber jedes hat seine Grenzen. Zum Beispiel haben Tiermodelle, die mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) behandelt wurden, eine große Fülle von Informationen über Prozesse geliefert, die für den nigralen DA-Neuronenverlust und nachfolgende striatale Anpassungen wichtig sind, und auf die Rolle der Mitochondrien bei der PD-Pathogenese hingewiesen. Der pathogenetische Hintergrund des MPTP-Modells ist jedoch eher toxischer Natur als ein neurodegenerativer Prozess wie bei der humanen PD6. Weitere chemisch induzierbare Modelle sind 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) und Rotenon. 6-OHDA war der erste Wirkstoff, der verwendet wurde, um Parkinson durch selektive Akkumulation des Arzneimittels in den DA-Neuronen zu induzieren, was schließlich die Neuronen abtötet und zu Parkinson-ähnlichen Symptomen führt. Dieses Modell wurde zuerst für die Verfolgung der DA-Depletion verwendet, indem das Verhalten als Reaktion auf Amphetamin und Apomorphin7 untersucht wurde. Diese Methode der Parkinson-Induktion hat sich als nützlich für das Screening pharmakologischer Wirkstoffe erwiesen, die DA und seine Rezeptoren beeinflussen8. Während das 6-OHDA-Modell ein großartiges Modell ist, um quantifizierbare motorische Defizite zu verfolgen, zeigt dieses Modell nicht, wie sich der allmähliche Verlust von Neuronen und die Bildung von Lewy-Körpern auf das Tier auswirken. Es wurde gezeigt, dass die andere Induktionsmethode, Rotenon, eine fortschreitende Degeneration von nigrostriatalen Neuronen mit dem Verlust von Tyrosinhydroxylase und DA-Transporter aufweist, was ein besseres Modell zur Verfolgung des Verlusts von Neuronen im Laufe der Zeit ermöglicht9. Die mit Rotenon behandelten Ratten zeigten Bradykinesie, Haltungsinstabilität und unsicheren Gang10. Es wurde jedoch festgestellt, dass diese Methode zwischen verschiedenen Rattenstämmen sehr unterschiedlich ist, was die Frage aufgeworfen hat, ob Rotenon ein zuverlässiges PD-Modellist oder nicht 11,12,13. Während gezeigt wurde, dass die Ganganalyse durch die Induktion von Parkinson bei Ratten beeinflusst wird, wurden genetisch induzierte PD-Rattenmodelle bisher nicht ohne weiteres für die Ganganalyse verwendet, indem sie frei auf einer Landebahn liefen.
Eine Möglichkeit, motorische Beeinträchtigungen bei frei gehenden Nagetieren zu analysieren, ist die kinematische Ganganalyse, die mit Hilfe von FTIR-Bildgebung durchgeführt werden kann. Diese etablierte Methode verwendet einen optischen Berührungssensor auf Basis von FTIR, der die Fußabdrücke der Nagetiere aufzeichnet und verfolgt, während sie sich auf der Landebahn14,15,16 bewegen. Im Vergleich zu anderen Methoden hängt FTIR nicht von Markern am Körper des Tieres ab, die die Pfotenabdrücke stören könnten. Durch die Generierung der Videodaten werden digitale Pfotenabdrücke aller vier Gliedmaßen erzeugt, die zu einem dynamischen und reproduzierbaren Laufmuster für verschiedene Nagetiermodelle kombiniert werden können. Das Prinzip der bildgebenden Ganganalyse besteht darin, jede einzelne Pfote zu nehmen und die Kontaktfläche im Laufe der Zeit zu messen, während das Nagetier die Landebahn hinuntergeht. Jede Haltung wird durch eine Vergrößerung der Pfotenfläche (in der Bremsphase) und eine Abnahme der Pfotenfläche (in der Antriebsphase) dargestellt. Dem geht die Schwungphase voraus, in der kein Pfotensignal erkannt wird. Nach der Auswertung des Videos werden mehrere Parameter generiert, mit denen Wildtyp (WT) mit PD-Modell verglichen werden kann. Einige Beispiele für die Parameter sind die Schrittlänge (die Strecke, die die Pfote in einem Schritt zurücklegt), die Schwungdauer (die Zeit, in der die Pfote keinen Kontakt mit der Landebahn hat), die Schwunggeschwindigkeit (Schrittlänge als Funktion der Schwungdauer) und das Schrittmuster (diagonale Schritte, seitliche Schritte oder Gürtelschritte).
Um den Nutzen von FTIR zur Aufdeckung früher Veränderungen des Gangmusters bei Ratten zu demonstrieren, verwendeten wir ein genetisches Rattenmodell der Parkinson-Krankheit. Während die meisten Fälle von Parkinson idiopathisch sind; Die Identifizierung erblicher Formen von Parkinson deckte Genmutationen und -varianten auf, wie z.B. Funktionsverlust-Mutationen in Pink1 und Parkin, zwei Proteinen, die an der mitochondrialen Qualitätskontrollebeteiligt sind 17, die zur Erstellung von Tiermodellen genutzt werden könnten18. Leider sind Mäuse resistent gegen Neurodegeneration, wenn diese Proteine (einzeln und kombiniert) verloren gehen19,20,21. Bei Ratten führt ein Pink1-Mangel, nicht aber ein Parkin-Mangel, zu einem nigralen DA-Neuronenverlust und motorischen Beeinträchtigungen22, jedoch ohne vollständige Penetranz. Daher haben wir ein kombiniertes Pink1/Parkin-Doppel-Knockout-Rattenmodell (DKO) erstellt, das den offensichtlichen, visuell sichtbaren Phänotyp des Ziehens der Hinterbeine zeigt, der bei männlichen Pink1-KO-Ratten22 berichtet wurde, aber jetzt mit einer höheren Rate: 100% gegenüber 30-50% der Männchen zwischen 4-6 Monaten.
Während diese Methode gut für die Analyse von motorischen Defiziten bei Mäusengeeignet ist 14, waren FTIR-Bildgebungs-Gangsystemspezifikationen zur Berücksichtigung der Größe und des Gewichts von Ratten bisher nicht kommerziell verfügbar. Hier erklären wir, wie man den RatWalker baut, ein modifiziertes FTIR-Gangbildgebungssystem, das dem MouseWalker14 nachempfunden ist, außer dass es an die Größe und das Gewicht von Ratten angepasst ist. Dieses System nutzt einen optischen Effekt, FTIR, um eine Methode zur Visualisierung und anschließenden Aufzeichnung von Tierfußabdrücken für die Analyse bereitzustellen. Der Kontakt des Fußes eines Tieres mit dem Lichtwellenleiter (Plattform) führt zu einer Unterbrechung des Lichtwegs, was zu einem sichtbaren Streueffekt führt, der mit Hochgeschwindigkeits-Videografie und Verarbeitung mit Open-Source-Software erfasst wird. Diese Studie zeigt die Leistungsfähigkeit der FTIR-Bildgebung bei der Untersuchung von Gangveränderungen in genetischen Rattenmodellen der Parkinson-Krankheit. Während zum Beispiel bei männlichen DKO-Ratten frühestens nach 4 Monaten sichtbare visuell sichtbare motorische Veränderungen (z.B. Ziehen der Hinterbeine) beobachtet werden, können wir mit FTIR Gate-Anomalien bei männlichen DKO-Ratten im Alter von 2 Monaten aufdecken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gangstörungen, einschließlich verminderter Armschwingung, langsamerer Gehgeschwindigkeit und kürzerer Schritte, sind ein bestimmendes Merkmal der Parkinson-Krankheit und treten früh im Krankheitsverlaufauf 1,5. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Methoden entwickelt, um die Trittfrequenz für die Ganganalyse in Nagetiermodellen der Parkinson-Krankheit zu beobachten und aufzuzeichnen, wobei manuelle Techniken zur Quantifizierung der Trittposition zu automatisier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KS und HF danken der Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research für die Unterstützung ihrer Arbeit zur Parkinson-Krankheit.
Materials
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
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| 1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
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| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
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| 1” Aluminum Tube (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
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| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
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| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
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| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
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| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
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| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
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| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
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