Aplicando o Sistema RatWalker para Análise de Marcha em um Modelo de Rato Genético da Doença de Parkinson

Summary

Aqui descrevemos o sistema RatWalker, construído redesenhando o aparelho MouseWalker para acomodar o aumento do tamanho e peso dos ratos. Este sistema usa reflexão interna total frustrada (FTIR), captura de vídeo de alta velocidade e software de análise de acesso aberto para rastrear e quantificar os parâmetros da marcha.

Abstract

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo causado pela perda de neurônios dopaminérgicos (DA) na substância negra pars compacta. Anormalidades na marcha, incluindo diminuição do balanço do braço, velocidade de caminhada mais lenta e passos mais curtos são comuns em pacientes com DP e aparecem no início do curso da doença. Assim, a quantificação de padrões motores em modelos animais de DP será importante para a caracterização fenotípica durante o curso da doença e no tratamento terapêutico. A maioria dos casos de DP é idiopática; no entanto, a identificação de formas hereditárias de DP revelou mutações e variantes genéticas, como mutações de perda de função em Pink1 e Parkin, duas proteínas envolvidas no controle de qualidade mitocondrial que poderiam ser aproveitadas para criar modelos animais. Enquanto os ratos são resistentes à neurodegeneração após a perda de Pink1 e Parkin (deleção única e combinada), em ratos, a deficiência de Pink1, mas não de Parkin, leva à perda do neurônio DA nigral e ao comprometimento motor. Aqui, relatamos a utilidade da imagem FTIR para descobrir alterações na marcha em ratos machos jovens (2 meses de idade) com perda combinada de Pink1 e Parkin antes do desenvolvimento de anormalidade motora visualmente aparente grosseira à medida que esses ratos envelhecem (observada aos 4-6 meses), caracterizada pelo arrasto dos membros posteriores, conforme relatado anteriormente em ratos Pink1 knockout (KO).

Introduction

A DP, o distúrbio do movimento neurodegenerativo relacionado à idade mais comum, é causada pela perda de neurônios DA na substância negra pars compacta. Essa perda de neurônios DA nigral e as entradas de DA no estriado levam aos comprometimentos da função motora observados em pacientes com DP ^1,2. As características motoras definidoras de pacientes com DP, conhecidas coletivamente como parkinsonismo, incluem rigidez, tremor de repouso, bradicinesia, instabilidade postural e micrografia³. Além disso, os distúrbios da marcha, comuns em pacientes com DP, aparecem precocemente no curso da doença ^1,4,5. Embora certos estilos de vida sejam sugeridos para ajudar a retardar a progressão da DP, como alimentação saudável e exercícios regulares, atualmente não há cura para a DP, apenas medicamentos para gerenciar os sintomas. Isso deixa espaço para a necessidade de uma investigação mais aprofundada na esperança de melhorar a terapêutica. Assim, a caracterização do padrão de marcha em modelos animais de DP é uma ferramenta crucial para caracterizar a relevância do modelo, bem como como os tratamentos terapêuticos voltados para o controle da DP estão prevenindo ou melhorando os comprometimentos motores.

Existem vários modelos animais de DP que têm sido utilizados para testar tratamentos terapêuticos, no entanto, cada um tem suas limitações. Por exemplo, modelos animais tratados com a neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) produziram uma grande riqueza de informações sobre processos importantes para a perda do neurônio DA nigral e subsequentes adaptações estriatais, e apontaram para o papel das mitocôndrias na patogênese da DP; no entanto, o contexto patogênico do modelo MPTP é de natureza tóxica e não neurodegenerativa, como na DP humana⁶. Modelos quimicamente induzíveis adicionais incluem 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e rotenona. A 6-OHDA foi o primeiro agente usado para induzir a DP pelo acúmulo seletivo da droga nos neurônios DA, o que eventualmente mata os neurônios e leva a sintomas semelhantes aos da DP. Este modelo foi usado pela primeira vez para o rastreamento da depleção de DA, examinando o comportamento em resposta à anfetamina e apomorfina⁷. Esse método de indução da DP tem se mostrado útil para o rastreamento de agentes farmacológicos que impactam a AD e seus receptores⁸. Embora o modelo 6-OHDA seja um ótimo modelo para rastrear déficits motores quantificáveis, esse modelo não mostra como a perda gradual de neurônios e a formação de corpos de Lewy afetam o animal. O outro método de indução, a rotenona, demonstrou ter degeneração progressiva dos neurônios nigrostriatais com a perda de tirosina hidroxilase e transportador DA, permitindo um melhor modelo para rastrear a perda de neurônios ao longo do tempo⁹. Os ratos tratados com rotenona apresentaram bradicinesia, instabilidade postural e marcha instável¹⁰. No entanto, esse método tem se mostrado amplamente variável entre diferentes cepas de ratos, o que tem provocado questionamentos se a rotenona é ou não um modelo confiável de DP^11,12,13. Embora a análise da marcha tenha demonstrado ser impactada pela indução de DP em ratos, até o momento, os modelos de ratos com DP geneticamente induzidos não foram prontamente usados para análise de marcha andando livremente por uma pista.

Uma maneira de analisar o comprometimento motor em roedores que caminham livremente é a análise cinemática da marcha, que pode ser realizada utilizando imagens FTIR. Esse método estabelecido utiliza um sensor óptico de toque baseado em FTIR, que registra e rastreia as pegadas dos roedores à medida que eles se movem pela pista^14,15,16. Em comparação com outros métodos, o FTIR não depende de nenhum marcador no corpo do animal que possa interferir nas impressões das patas. A geração dos dados de vídeo produz impressões digitais de todas as quatro partes que podem ser combinadas para criar um padrão de caminhada dinâmico e reprodutível para vários modelos de roedores. O princípio da análise de marcha baseada em imagens é pegar cada pata individual e medir a área de contato ao longo do tempo enquanto o roedor caminha pela pista. Cada postura é representada por um aumento na área da pata (na fase de frenagem) e uma diminuição na área da pata (na fase de propulsão). Isso é prosseguido pela fase de balanço, que é quando não há sinal de pata detectado. Após a avaliação do vídeo, são gerados vários parâmetros que podem ser usados para comparar o tipo selvagem (WT) versus o modelo PD. Alguns exemplos dos parâmetros são o comprimento do passo (distância que a pata cobre em um passo), a duração do balanço (duração do tempo em que a pata não está em contato com a pista), a velocidade do balanço (comprimento do passo em função da duração do balanço) e o padrão do passo (passos diagonais, degraus laterais ou passos de cinto).

Para demonstrar a utilidade do FTIR para descobrir mudanças precoces no padrão de marcha em ratos, usamos um modelo genético de DP em ratos. Enquanto a maioria dos casos de DP são idiopáticos; a identificação de formas hereditárias de DP revelou mutações e variantes genéticas, como mutações de perda de função em Pink1 e Parkin, duas proteínas envolvidas no controle de qualidade mitocondrial¹⁷, que poderiam ser aproveitadas para criar modelos animais¹⁸. Infelizmente, camundongos são resistentes à neurodegeneração após a perda dessas proteínas (únicas e combinadas)19,20,21. Em ratos, a deficiência de Pink1, mas não de Parkin, leva à perda do neurônio DA nigral e a deficiências motoras²², mas sem penetrância completa. Portanto, geramos um modelo combinado de ratos Pink1/Parkin double knockout (DKO), que exibe o fenótipo de arrasto do membro posterior visualmente aparente relatado em ratos machos Pink1 KO²², mas agora em uma taxa mais alta: 100% versus 30-50% dos machos entre 4-6 meses.

Embora esse método funcione bem para analisar déficits motores em camundongos¹⁴, as especificações do sistema de marcha de imagem FTIR para acomodar o tamanho e o peso dos ratos anteriormente não estavam disponíveis comercialmente. Aqui explicamos como construir o RatWalker, um sistema de imagem de marcha FTIR modificado modelado após o MouseWalker¹⁴, exceto adaptado para o tamanho e peso dos ratos. Este sistema utiliza um efeito óptico, FTIR, para fornecer um método para visualizar e, posteriormente, registrar pegadas de animais para análise. O contato do pé de um animal com o guia de ondas ópticas (plataforma) causa interrupção no caminho da luz, resultando em um efeito de dispersão visível, que é capturado usando videografia doméstica de alta velocidade e processamento usando software de código aberto. Este estudo demonstra o poder da imagem FTIR no estudo de alterações na marcha em modelos genéticos de DP em ratos. Por exemplo, enquanto alterações motoras visualmente aparentes evidentes (ou seja, arrasto dos membros posteriores) são observadas em ratos machos com DKO aos 4 meses no mínimo, usando FTIR somos capazes de descobrir anormalidades de porta em ratos machos DKO aos 2 meses de idade.

Protocol

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Nebraska (IACUC). 1. Aparelho de marcha NOTA: Modelado a partir do MouseWalker14, o RatWalker foi projetado com dimensões proporcionais à diferença no comprimento do passo entre ratos e camundongos. Consiste em uma luz de fundo de iluminação lateral, gabinete de passarela, passarela de guia de onda óptic…

Representative Results

Manutenção da Colônia de RatosA geração e caracterização de ratos Pink1 e Parkin single KO já foram descritas anteriormente22. Os ratos Pink1 e Parkin single KO foram obtidos do SAGE Labs (e agora disponíveis no Envigo). Ratos DKO foram gerados pelo cruzamento de ratos Pink1-/- com ratos Parkin-/- para obtenção de ratos Pink1+/-/Parkin+/- que foram cruzados para obtenção de ratos Pink1-/-/Parkin-/<s…

Discussion

Distúrbios da marcha, incluindo diminuição do balanço do braço, velocidade de caminhada mais lenta e passos mais curtos, são uma característica definidora da DP e ocorrem precocemente durante o curso da doença ^1,5. Vários métodos têm sido desenvolvidos ao longo dos anos para observar e registrar passos para análise de marcha em modelos de roedores de DP, com técnicas manuais para quantificar a posição do pisar levando a abordagens automatizadas mai…

Materials

Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1