Bruk av RatWalker-systemet for ganganalyse i en genetisk rottemodell av Parkinsons sykdom

Summary

Her beskriver vi RatWalker-systemet, bygget ved å redesigne MouseWalker-apparatet for å imøtekomme den økte størrelsen og vekten av rotter. Dette systemet bruker frustrert total intern refleksjon (FTIR), høyhastighets videoopptak og åpen tilgangsanalyseprogramvare for å spore og kvantifisere gangparametere.

Abstract

Parkinsons sykdom (PD) er en progressiv nevrodegenerativ lidelse forårsaket av tap av dopaminerge (DA) nevroner i substantia nigra pars compacta. Gangavvik, inkludert redusert armsving, langsommere ganghastighet og kortere trinn er vanlige hos PD-pasienter og vises tidlig i sykdomsforløpet. Kvantifisering av motoriske mønstre i dyremodeller av PD vil derfor være viktig for fenotypisk karakterisering ved sykdomsforløp og ved terapeutisk behandling. De fleste tilfeller av PD er idiopatiske; Identifiseringen av arvelige former for PD avdekket imidlertid genmutasjoner og varianter, for eksempel tap av funksjonsmutasjoner i Pink1 og Parkin, to proteiner involvert i mitokondriell kvalitetskontroll som kunne utnyttes for å lage dyremodeller. Mens mus er resistente mot nevrodegenerasjon ved tap av Pink1 og Parkin (enkel og kombinert delesjon), hos rotter, fører Pink1, men ikke Parkin-mangel til nigral DA-nevrontap og motorisk funksjonsnedsettelse. Her rapporterer vi nytten av FTIR-avbildning for å avdekke gangforandringer hos fritt gående unge (2 måneder) hannrotter med kombinert tap av Pink1 og Parkin før utvikling av grov visuelt tydelig motorisk abnormitet når disse rottene eldes (observert ved 4-6 måneder), karakterisert ved at baklemmer drar som tidligere rapportert hos Pink1 knockout (KO) rotter.

Introduction

PD, den vanligste aldersrelaterte nevrodegenerative bevegelsesforstyrrelsen, skyldes tap av DA-nevroner i substantia nigra pars compacta. Dette tapet av nigral DA-nevroner og DA-inngangene i striatum fører til de observerte motoriske funksjonsnedsettelsene sett hos pasienter med PD ^1,2. De definerende motoriske egenskapene til pasienter med PD, kjent kollektivt som parkinsonisme, inkluderer stivhet, hviletremor, bradykinesi, postural ustabilitet og mikrografi³. Videre opptrer gangforstyrrelser, som er vanlige hos PD-pasienter, tidlig i sykdomsforløpet ^1,4,5. Mens visse livsstiler foreslås å bidra til å redusere utviklingen av PD, for eksempel sunn mat og regelmessig mosjon, er det for tiden ingen kur mot PD, bare medisiner for å håndtere symptomene. Dette gir rom for behovet for ytterligere undersøkelser i håp om forbedret terapi. Dermed er karakterisering av gangmønsteret i PD-dyremodeller et avgjørende verktøy for å karakterisere modellens relevans, samt hvordan terapeutiske behandlinger rettet mot å kontrollere PD forebygger eller forbedrer motoriske funksjonsnedsettelser.

Det finnes ulike PD-dyremodeller som har blitt brukt til å teste terapeutiske behandlinger, men hver har sine begrensninger. For eksempel har dyremodeller behandlet med nevrotoksin 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) gitt en stor mengde informasjon om prosesser som er viktige for nigral DA nevrontap og påfølgende striatale tilpasninger, og pekte på mitokondrienes rolle i PD-patogenesen; Den patogenetiske bakgrunnen til MPTP-modellen er imidlertid av giftig natur snarere enn en nevrodegenerativ prosess som i human PD⁶. Ytterligere kjemisk induserbare modeller inkluderer 6-hydroksydopamin (6-OHDA) og rotenon. 6-OHDA var det første middelet som ble brukt til å indusere PD ved selektiv akkumulering av stoffet i DA-nevronene, som til slutt dreper nevronene og fører til PD-lignende symptomer. Denne modellen ble først brukt til sporing av DA-uttømming ved å undersøke oppførselen som respons på amfetamin og apomorfin⁷. Denne metoden for PD-induksjon har vist seg å være nyttig for screening av farmakologiske midler som påvirker DA og dets reseptorer⁸. Mens 6-OHDA-modellen er en flott modell for sporing av kvantifiserbare motorunderskudd, viser denne modellen ikke hvordan det gradvise tapet av nevroner og dannelse av Lewy-legemer påvirker dyret. Den andre induksjonsmetoden, rotenon, har vist seg å ha progressiv degenerasjon av nigrostriatale nevroner med tap av tyrosinhydroksylase og DA-transportør, noe som muliggjør en bedre modell for å spore tap av nevroner over tid⁹. De rotenonbehandlede rottene viste bradykinesi, postural ustabilitet og ustø gange¹⁰. Imidlertid har denne metoden vist seg å være svært variabel mellom forskjellige stammer av rotter, noe som har provosert spørsmål om rotenon er en pålitelig PD-modell^11,12,13. Mens ganganalyse har vist seg å bli påvirket av induksjon av PD hos rotter, har hittil genetisk induserte PD-rottemodeller ikke blitt lett brukt til ganganalyse ved å gå fritt nedover en rullebane.

En måte å analysere motorisk svekkelse hos fritt gående gnagere er kinematisk ganganalyse, som kan utføres ved å bruke FTIR-avbildning. Denne etablerte metoden bruker en optisk berøringssensor basert på FTIR, som registrerer og sporer fotavtrykkene til gnagere når de beveger seg nedover rullebanen^14,15,16. Sammenlignet med andre metoder er ikke FTIR avhengig av markører på dyrets kropp som kan forstyrre poteavtrykkene. Generering av videodataene produserer digitale poteavtrykk av alle fire lemmer som kan kombineres for å skape et dynamisk og reproduserbart gangmønster for ulike gnagermodeller. Prinsippet for bildebasert ganganalyse er å ta hver enkelt pote og måle kontaktområdet over tid når gnageren går nedover rullebanen. Hver holdning er representert ved en økning i poteområdet (i bremsefasen) og en reduksjon i poteområdet (i fremdriftsfasen). Dette fortsetter av svingfasen, som er når det ikke oppdages potesignal. Etter evaluering av videoen genereres flere parametere som kan brukes til å sammenligne villtype (WT) versus PD-modell. Noen eksempler på parametrene er trinnlengde (avstand poten dekker i ett trinn), svingvarighet (varighet av tiden poten ikke er i kontakt med rullebanen), svinghastighet (trinnlengde som funksjon av svingvarighet) og trinnmønster (diagonale trinn, sidetrinn eller beltetrinn).

For å demonstrere nytten av FTIR for å avdekke tidlige endringer i gangmønster hos rotter, brukte vi en genetisk rottemodell av PD. Mens de fleste tilfeller av PD er idiopatiske; identifiseringen av arvelige former for PD avdekket genmutasjoner og varianter, for eksempel tap av funksjonsmutasjoner i Pink1 og Parkin, to proteiner involvert i mitokondriell kvalitetskontroll¹⁷, som kunne utnyttes for å lage dyremodeller¹⁸. Dessverre er mus resistente mot nevrodegenerasjon ved tap av disse proteinene (enkelt og kombinert)19,20,21. Hos rotter fører Pink1, men ikke Parkin-mangel, til nigral DA nevrontap og motoriske funksjonsnedsettelser²², men uten fullstendig penetrans. Derfor genererte vi en kombinert Pink1/Parkin double knockout (DKO) rottemodell, som viser den åpenbare visuelt synlige bakkroppsdragende fenotypen rapportert hos mannlige Pink1 KO-rotter²², men nå med en høyere hastighet: 100% mot 30-50% av hannene mellom 4-6 måneder.

Selv om denne metoden fungerer bra for å analysere motoriske underskudd hos mus¹⁴, var spesifikasjoner for FTIR-bildegangsystem for å imøtekomme størrelsen og vekten til rotter tidligere utilgjengelig ikke-kommersielt. Her forklarer vi hvordan du bygger RatWalker, et modifisert FTIR-gangbildesystem modellert etter MouseWalker¹⁴, bortsett fra tilpasset rotters størrelse og vekt. Dette systemet benytter en optisk effekt, FTIR, for å gi en metode for å visualisere og deretter registrere dyreavtrykk for analyse. Kontakt av et dyrs fot med den optiske bølgelederen (plattformen) forårsaker forstyrrelser i lysbanen, noe som resulterer i en synlig spredningseffekt, som fanges opp ved hjelp av innenlands, høyhastighets videografi og behandling ved hjelp av åpen kildekode-programvare. Denne studien demonstrerer kraften til FTIR-avbildning i å studere gangendringer i genetiske rottemodeller av PD. For eksempel, mens åpenbare visuelt synlige motoriske forandringer (dvs. bakkroppsdraging) observeres hos DKO-hannrotter tidligst ved 4 måneder, kan vi ved bruk av FTIR avdekke portabnormaliteter hos DKO-hannrotter ved 2 måneders alder.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av University of Nebraska Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Gangapparat MERK: RatWalker er modellert fra MouseWalker14, og ble designet med dimensjoner i forhold til forskjellen i trinnlengde mellom rotter og mus. Den består av en sidebelysning bakgrunnsbelysning, gangvei kabinett, optisk waveguide gangvei, speil og kamera (figur S1). LED-striper, orientert i f…

Representative Results

Vedlikehold av rottekoloniGenerering og karakterisering av Pink1 og Parkin single KO-rotter er beskrevet tidligere22. Pink1 og Parkin enkelt KO rotter ble hentet fra SAGE Labs (og nå tilgjengelig fra Envigo). DKO-rotter ble generert ved å krysse Pink1-/- rotter med Parkin-/- rotter for å få Pink1+/-/Parkin+/- rotter, som ble blandet for å oppnå Pink1-/-/Parkin-/- rotter (vil være til…

Discussion

Gangforstyrrelser, inkludert redusert armsving, langsommere ganghastighet og kortere trinn, er et definerende trekk ved PD, og opptrer tidlig i sykdomsforløp ^1,5. Flere metoder har blitt utviklet gjennom årene for å observere og registrere fotfall for ganganalyse i gnagermodeller av PD, med manuelle teknikker for å kvantifisere fotfallposisjon som fører til automatiserte tilnærminger som er mer følsomme og i stand til å fange dynamiske parametere. Noen st…

Materials

Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1