إجراءات استئصال الغدد و أخذ عينات الدم في نموذج تيليوست صغير الحجم الياباني ميداكا (Oryzias latipes)
Summary
ويصف المقال بروتوكول سريع لgonadectomize وعينة الدم من الأسماك تيليوست الصغيرة، وذلك باستخدام ميداكااليابانية (Oryzias latipes)كنموذج، للتحقيق في دور المنشطات الجنس في فسيولوجيا الحيوان.
Abstract
المنشطات الجنسية, التي تنتجها الغدد التناسلية, تلعب دورا أساسيا في الدماغ والأنسجة النخامية اللدونة وفي السيطرة العصبية الصماء من التكاثر في جميع الفقاريات من خلال توفير التغذية المرتدة للدماغ والغدة النخامية. تمتلك أسماك تيليوست درجة أعلى من اللدونة النسيجية والاختلاف في استراتيجيات الإنجاب مقارنة بالثدييات ويبدو أنها نماذج مفيدة للتحقيق في دور المنشطات الجنسية والآليات التي تعمل بها. إزالة المصدر الرئيسي لإنتاج الستيرويد الجنس باستخدام استئصال الغدد المنوية جنبا إلى جنب مع أخذ عينات الدم لقياس مستويات الستيرويد وقد راسخة وممكنة إلى حد ما في الأسماك أكبر وتقنية قوية للتحقيق في دور وآثار المنشطات الجنس. ومع ذلك، تثير هذه التقنيات تحديات عند تنفيذها في نماذج تيليوست صغيرة الحجم. هنا، نقوم بوصف الإجراءات خطوة بخطوة لاستئصال الغدد في كل من الذكور والإناث في ميداكا اليابانية تليها أخذ عينات الدم. وتبين أن هذه البروتوكولات ممكنة للغاية في ميداكا التي يشير إليها ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة، والسلامة لمدى الحياة والنمط الظاهري للأسماك، والاستنساخ من حيث إزالة الستيرويد الجنسي. استخدام هذه الإجراءات جنبا إلى جنب مع مزايا أخرى لاستخدام هذا النموذج تيليوست الصغيرة سوف تحسن كثيرا من فهم آليات التغذية المرتدة في السيطرة العصبية الصماء من التكاثر واللدونة الأنسجة التي توفرها المنشطات الجنس في الفقاريات.
Introduction
في الفقاريات، المنشطات الجنسية، والتي تنتج أساسا من قبل الغدد التناسلية، تلعب أدوارا هامة في تنظيم محور الدماغ- الغدة النخامية-غدد (BPG) من خلال آليات التغذية المرتدة المختلفة1،2،3،4،5. وبالإضافة إلى ذلك، المنشطات الجنس تؤثر على انتشار ونشاط الخلايا العصبية في الدماغ6،7،8 وخلايا الغدد الصماء ، بما في ذلك gonadotropes ، في الغدة النخامية9،10، وبالتالي تخدم أدوارا حاسمة في الدماغ واللدونة النخامية. على الرغم من المعرفة الجيدة نسبيا في الثدييات، وآلية تنظيم محور BPG بوساطة المنشطات الجنس أبعد ما يكون عن أن يفهم في الأنواع غير الثديية، مما يؤدي إلى فهم ضعيف للمبادئ التطورية المحفوظة11. لا يزال هناك عدد محدود من الدراسات التي توثق دور المنشطات الجنسية على اللدونة الدماغ والغدة النخامية, مما يزيد من الحاجة إلى مزيد من التحقيقات في دور وآثار المنشطات الجنسية على الأنواع الفقارية المتنوعة.
من بين الفقاريات، أصبحت teleosts الحيوانات نموذج قوية في معالجة العديد من الأسئلة البيولوجية والفسيولوجية، بما في ذلك استجابة الإجهاد12،13،نمو14،15،علم وظائف الأعضاء الغذائية16،17 والتكاثر2. Teleosts, التي يتم تمثيل معظمها المنشطات الجنس من قبل استراديول (E2) في الإناث و 11 كيتوتستوستيرون (11-KT) في الذكور18,19, منذ فترة طويلة نماذج تجريبية موثوق بها للتحقيق في المبدأ العام للتكاثر عبر الأنواع. Teleosts تظهر تفرد في اتصالها تحت المهاد والغدة النخامية20،21 وخلايا gonadotropeمتميزة 22، والتي هي في بعض الأحيان مريحة لتوضيح الآليات التنظيمية. وعلاوة على ذلك، ونظرا لقدرتها على كل من التجارب المختبرية والميدانية، فإن الخلايا التليوستية توفر مزايا كثيرة مقارنة بالكائنات الحية الأخرى. فهي غير مكلفة نسبيا لشراء وصيانة23،24. على وجه الخصوص، نماذج تيليوست صغيرة مثل حمار وحشي(دانيو ريو)وmedakaاليابانية (Oryzias latipes)،هي الأنواع ذات البراز عالية جدا ودورة حياة قصيرة نسبيا تمكين التحليل السريع لوظيفة الجينات وآليات المرض23،وبالتالي توفير مزايا أكبر في معالجة عدد كبير من الأسئلة البيولوجية والفسيولوجية، والنظر في العديد من البروتوكولات المتطورة جيدا والأدوات الوراثية المتاحة لهذه الأنواع25.
في العديد من الدراسات، تم استخدام إزالة الغدد التناسلية (استئصال الغدد التناسلية) جنبا إلى جنب مع تقنيات أخذ عينات الدم كوسيلة للتحقيق في العديد من الأسئلة الفسيولوجية، بما في ذلك تأثيره في فسيولوجيا الإنجاب الفقارية في الثدييات26و27و28والطيور29 والبرمائيات30. على الرغم من أن تأثير استئصال الغدد التناسلية على فسيولوجيا الإنجاب يمكن أن يحاكي بدلا من ذلك من قبل الخصوم الستيرويد الجنس, مثل تاموكسيفين وكلوميفين, تأثير الأدوية ويبدو أن تكون غير متناسقة بسبب آثار ثنائية الوسائط31,32. التعرض المزمن لخصم الستيرويد الجنس قد يؤدي إلى توسيع المبيض33,34, والتي قد تعطيل مراقبة آثاره لأغراض طويلة الأجل بسبب النمط الظاهري غير صحية. وبالإضافة إلى ذلك, فمن المستحيل إجراء تجربة الانتعاش بعد العلاج خصم الستيرويد الجنس, لتبرير تأثير محدد من المنشطات الجنس معينة. جنبا إلى جنب مع تلك النقاط المذكورة أعلاه, المقايضات الأخرى من استخدام خصم الستيرويد الجنس وقد استعرضت على نطاق واسع31,32. لذلك, استئصال الغدد المنوية لا يزال يظهر اليوم كتقنية قوية للتحقيق في دور المنشطات الجنس.
في حين أن تقنيات استئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم سهلة نسبيا في الأنواع الأكبر ، مثل باس البحر الأوروبي (Dicentrarchus labrax)35، بلوهيد wrasse (Thalassoma bifasciatum)36، الكلب (Scyliorhinus canicula)37 وسمك السلور (Heteropneustes fossilis و Clarias bathracus)38،39، يثيرون التحديات عند تطبيقها في الأسماك الصغيرة كما ميداكا. على سبيل المثال، استخدام نظام توصيل التخدير السمك (FADS)40 هو أقل جدوى ويبدو أن تكون عرضة للتلف البدني المفرط للأسماك الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن إجراء استئصال الغدد التي تستخدم عادة لأكبر الأسماك40 ليست مناسبة للأسماك الصغيرة التي تتطلب دقة عالية لتجنب الضرر المفرط. وأخيرا، فإن أخذ عينات الدم يشكل تحديا بسبب محدودية الوصول إلى الأوعية الدموية وكمية الدم الصغيرة في تلك الحيوانات. لذلك ، فإن بروتوكولا واضحا يوضح كل خطوة من خطوات استئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم في تيليوست صغير أمر مهم.
يوضح هذا البروتوكول الإجراءات التدريجية لاستئصال الغدد الدموية متبوعة بأخذ عينات الدم في ميداكا اليابانية، وهي سمكة صغيرة من أسماك المياه العذبة موطنها شرق آسيا. ميداكا اليابانية لديها الجينوم تسلسل، العديد من الأدوات الجزيئية والجينية المتاحة25،ونظام تحديد الجنس الوراثية التي تسمح للتحقيق في الاختلافات الجنسية قبل الخصائص الجنسية الثانوية أو النواد متطورة41. ومن المثير للاهتمام، تمتلك ميداكا اليابانية النجنات تنصهر خلافا لكثير من الأنواع الأخرى teleost42. هذه التقنيتين مجتمعة يستغرق سوى 8 دقائق في المجموع، وسوف تكمل قائمة بروتوكولات الفيديو الموجودة بالفعل لهذا النوع التي شملت وضع العلامات على الأوعية الدموية43,التصحيح المشبك على أقسام الغدة النخامية44 والخلايا العصبية في الدماغ45, وثقافة الخلايا الأولية46. هذه التقنيات سوف تسمح للمجتمع البحثي للتحقيق وفهم أفضل لأدوار المنشطات الجنس في آليات التغذية المرتدة، فضلا عن اللدونة الدماغ والغدة النخامية في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ورد في الأدبيات السابقة, وقد استخدمت منذ فترة طويلة استئصال الغدد المنوية وأخذ عينات الدم في الأنواع النموذجية الأخرى للتحقيق في المسائل المتعلقة بدور المنشطات الجنس في تنظيم محور BPG. ومع ذلك ، يبدو أن هذه التقنيات قابلة فقط للحيوانات الأكبر. وبالنظر إلى صغر حجم نموذج تيليوست الشائع ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفان السيدة لورد كاريون جي تان على مساعدتها في تربية الأسماك. تم تمويل هذا العمل من قبل NMBU، والمنح في المعونة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) (منحة رقم 18H04881 و 18K19323)، ومنحة لمشاريع أبحاث العلوم الأساسية من مؤسسة سوميتومو إلى S.K.
Materials
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | – | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
- Weltzien, F. -. A., Andersson, E., Andersen, &. #. 2. 1. 6. ;., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B., Farrell, A. P. . Encyclopedia of Fish Physiology. 2, 1500-1508 (2011).
- Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
- Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
- Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
- Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
- Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
- Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
- Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
- Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -. A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
- Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
- Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
- Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
- Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
- Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
- MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
- Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
- Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
- Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
- Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
- Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
- Weltzien, F. -. A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones – Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
- Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
- Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
- Naruse, K., Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. . Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. , 19-37 (2011).
- Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
- Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
- Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
- Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
- McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
- Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
- Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
- Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
- Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
- Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
- Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
- Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
- Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
- Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
- Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
- Hori, H., Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. . Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. , 1-16 (2011).
- Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y., Murata, K., et al. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. 2, 49-95 (2019).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
- Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
- Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
- Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
- Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
- Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
- Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
- Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
- Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).
