Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (Oryzias latipes)

Summary

El artículo describe un protocolo rápido para gonadectomizar y tomar muestras de sangre de los pequeños peces teleóseos, utilizando medaka japonés(Oryzias latipes)como modelo, para investigar el papel de los esteroides sexuales en la fisiología animal.

Abstract

Los esteroides sexuales, producidos por las gónadas, juegan un papel esencial en la plasticidad del cerebro y el tejido pituitario y en el control neuroendocrino de la reproducción en todos los vertebrados al proporcionar retroalimentación al cerebro y la hipófisis. Los peces teleóstos poseen un mayor grado de plasticidad tisular y variación en las estrategias reproductivas en comparación con los mamíferos y parecen ser modelos útiles para investigar el papel de los esteroides sexuales y los mecanismos por los que actúan. La eliminación de la principal fuente de producción de esteroides sexuales mediante gonadectomía junto con el muestreo de sangre para medir los niveles de esteroides ha sido bien establecida y bastante factible en peces más grandes y es una técnica poderosa para investigar el papel y los efectos de los esteroides sexuales. Sin embargo, estas técnicas plantean desafíos cuando se implementan en modelos de teleósto de tamaño pequeño. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso de la gonadectomía en medaka japonés masculino y femenino seguido de un muestreo de sangre. Estos protocolos han demostrado ser altamente factibles en medaka indicados por una alta tasa de supervivencia, seguridad para la vida útil y el fenotipo de los peces, y reproducibilidad en términos de eliminación de esteroides sexuales. El uso de estos procedimientos combinado con las otras ventajas de usar este pequeño modelo de teleósto mejorará en gran medida la comprensión de los mecanismos de retroalimentación en el control neuroendocrino de la reproducción y la plasticidad tisular proporcionada por los esteroides sexuales en vertebrados.

Introduction

En los vertebrados, los esteroides sexuales, que son producidos principalmente por las gónadas, juegan un papel importante en la regulación del eje Cerebro-Hipófisis-Gonadal (BPG) a través de varios mecanismos de retroalimentación^1,2,3,4,5. Además, los esteroides sexuales afectan la proliferación y la actividad de las neuronas en el cerebro^6,7,8 y las células endocrinas, incluidos los gonadotropos, en la hipófisis^9,10,y por lo tanto cumplen funciones cruciales en el cerebro y la plasticidad pituitaria. A pesar de un conocimiento relativamente bueno en mamíferos, el mecanismo de regulación del eje BPG mediado por esteroides sexuales está lejos de ser entendido en especies no mamíferas, lo que lleva a una comprensión deficiente de los principios conservados evolutivamente¹¹. Todavía hay un número limitado de estudios que documentan el papel de los esteroides sexuales en el cerebro y la plasticidad pituitaria, lo que plantea la necesidad de más investigaciones sobre el papel y los efectos de los esteroides sexuales en diversas especies de vertebrados.

Entre los vertebrados, los teleóstos se han convertido en poderosos animales modelo para abordar numerosas preguntas biológicas y fisiológicas, incluida la respuesta al estrés^12,13,el crecimiento^14,15,la fisiología nutricional^16,17 y la reproducción^2. Los teleóstomos, en los que los esteroides sexuales están representados principalmente por estradiol (E2) en las hembras y 11-cetotestosterona (11-KT) en los machos^18,19,han sido durante mucho tiempo modelos experimentales confiables para investigar el principio general de reproducción en todas las especies. Los teleóstomos muestran singularidad en su conexión hipotalámico-hipofisaria^20,21 y distintas células gonadotropas^22,que a veces son convenientes para la elucidación de los mecanismos reguladores. Además, debido a su capacidad para experimentos de laboratorio y de campo, los teleóstodos ofrecen muchas ventajas en comparación con otros organismos. Son relativamente baratos de comprar y mantener^23,24. En particular, los pequeños modelos de teleósto como el pez cebra(Danio rerio)y el medaka japonés(Oryzias latipes),son especies con una fecundidad muy alta y un ciclo de vida relativamente corto que permite un análisis rápido de la función génica y los mecanismos de la enfermedad^23,proporcionando así ventajas aún mayores al abordar una gran cantidad de preguntas biológicas y fisiológicas, teniendo en cuenta los numerosos protocolos bien desarrollados y el conjunto de herramientas genéticas disponibles para estas especies²⁵.

En numerosos estudios, la eliminación de gónadas (gonadectomía) junto con técnicas de muestreo de sangre se han utilizado como método para investigar muchas cuestiones fisiológicas, incluido su impacto en la fisiología reproductiva de vertebrados en mamíferos^26,27,28,aves²⁹ y anfibios^30. Aunque el efecto de la gonadectomía sobre la fisiología reproductiva puede ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuales, como el tamoxifeno y el clomifeno, el efecto de los fármacos parece ser inconsistente debido a los efectos bimodales^31,32. La exposición crónica a un antagonista de esteroides sexuales puede conducir a un agrandamiento ovárico^33,34, lo que puede deshabilitar la observación de sus efectos para fines a largo plazo debido a un fenotipo poco saludable. Además, es imposible realizar un experimento de recuperación después del tratamiento con antagonistas de esteroides sexuales, para garantizar el efecto específico de ciertos esteroides sexuales. Junto con esos puntos antes mencionados, otras compensaciones del uso de antagonistas de esteroides sexuales han sido ampliamente revisadas^31,32. Por lo tanto, la gonadectomía todavía aparece hoy en día como una técnica poderosa para investigar el papel de los esteroides sexuales.

Si bien las técnicas de gonadectomía y muestreo de sangre son relativamente fáciles de realizar en especies más grandes, como la lubina europea(Dicentrarchus labrax)^35,el pez cabeza azul(Thalassoma bifasciatum)^36,el cazón(Scyliorhinus canicula)³⁷ y el bagre(Heteropneustes fossilis y Clarias bathracus)^38,39,plantean desafíos cuando se aplican en peces pequeños como medaka. Por ejemplo, el uso del Sistema de Administración de Anestesia de Peces (FADS)⁴⁰ es menos factible y parece ser propenso a daños físicos excesivos para los peces pequeños. Además, un procedimiento de gonadectomía que se usa comúnmente para peces más grandes⁴⁰ no es adecuado para peces pequeños que requieren alta precisión para evitar daños excesivos. Finalmente, el muestreo de sangre es un desafío debido al acceso limitado a los vasos sanguíneos y la pequeña cantidad de sangre en esos animales. Por lo tanto, es importante un protocolo claro que demuestre cada paso de la gonadectomía y el muestreo de sangre en un pequeño teleósto.

Este protocolo demuestra los procedimientos paso a paso de la gonadectomía seguidos de la toma de muestras de sangre en la medaka japonesa, un pequeño pez de agua dulce nativo del este de Asia. Los medaka japoneses tienen un genoma secuenciado, varias herramientas moleculares y genéticas disponibles^25,y un sistema genético de determinación del sexo que permite la investigación de las diferencias sexuales antes de que las características sexuales secundarias o gónadas estén bien desarrolladas⁴¹. Curiosamente, los medaka japoneses poseen gónadas fusionadas contrariamente a muchas otras especies de teleóstos⁴². Estas dos técnicas combinadas toman solo 8 minutos en total y completarán la lista de protocolos de video ya existentes para esta especie que incluyeron el etiquetado de los vasos sanguíneos^43,patch-clamp en las secciones hipofisarias⁴⁴ y neuronas cerebrales^45,y el cultivo celular primario^46. Estas técnicas permitirán a la comunidad de investigación investigar y comprender mejor los roles de los esteroides sexuales en los mecanismos de retroalimentación, así como la plasticidad cerebral y pituitaria en el futuro.

Protocol

Todas las experimentaciones y el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones sobre el bienestar animal experimental en la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida. Los experimentos con gonadectomía fueron aprobados por la Autoridad Noruega de Seguridad Alimentaria (FOTS ID 24305). NOTA: Los experimentos se realizaron utilizando machos y hembras adultos (6-7 meses de edad, peso aprox. 0,35 g, longitud aprox. 2,7 cm) medaka japonés. El sexo se determinó distingu…

Representative Results

Este protocolo describe cada paso para realizar gonadectomía y muestreo de sangre en un teleósto modelo de tamaño pequeño, el medaka japonés. La tasa de supervivencia de los peces después de la ovariectomía (OVX) en las hembras es del 100% (10 de cada 10 peces), mientras que el 94% (17 de 18 peces) de los machos sobrevivieron después de la orquidectomía. Mientras tanto, después de que se realizó el procedimiento de muestreo de sangre, todos los peces (38 peces) sobrevivieron.</…

Discussion

Como se informó en la literatura anterior, la gonadectomía y el muestreo de sangre se han utilizado durante mucho tiempo en otras especies modelo para investigar cuestiones relacionadas con el papel de los esteroides sexuales en la regulación del eje BPG. Sin embargo, estas técnicas parecen ser susceptibles sólo para animales más grandes. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño del modelo de teleósto comúnmente utilizado, el medaka japonés, proporcionamos un protocolo detallado para la gonadectomía y el muestreo…

Materials

Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		–	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry