Gonadectomie et procédures de prélèvement sanguin dans le modèle de téléostéen de petite taille Medaka japonais (Oryzias latipes)

Summary

L’article décrit un protocole rapide pour gondécatomiser et prélassez le sang du petit poisson téléostéen, en utilisant le medaka japonais(Oryzias latipes)comme modèle, pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels dans la physiologie animale.

Abstract

Les stéroïdes sexuels, produits par les gonfles, jouent un rôle essentiel dans la plasticité du cerveau et des tissus hypophysaires et dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction chez tous les vertébrés en fournissant une rétroaction au cerveau et à l’hypophyse. Les poissons téléostéens possèdent un degré plus élevé de plasticité tissulaire et de variation dans les stratégies de reproduction que les mammifères et semblent être des modèles utiles pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels et les mécanismes par lesquels ils agissent. L’élimination de la principale source de production de stéroïdes sexuels à l’aide de la gonadectomie avec un prélèvement sanguin pour mesurer les niveaux de stéroïdes a été bien établie et assez réalisable chez les gros poissons et est une technique puissante pour étudier le rôle et les effets des stéroïdes sexuels. Cependant, ces techniques soulèvent des défis lorsqu’elles sont mises en œuvre dans des modèles de téléostéen de petite taille. Ici, nous décrivons les procédures étape par étape de la gonadectomie chez les hommes et les femmes medaka japonais suivies d’un prélèvement sanguin. Ces protocoles se sont révélés hautement réalisables dans le medaka, ce qui indique un taux de survie élevé, la sécurité pour la durée de vie et le phénotype du poisson, et la reproductibilité en termes de clairance des stéroïdes sexuels. L’utilisation de ces procédures combinée aux autres avantages de l’utilisation de ce petit modèle de téléostéen améliorera considérablement la compréhension des mécanismes de rétroaction dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction et de la plasticité tissulaire fournis par les stéroïdes sexuels chez les vertébrés.

Introduction

Chez les vertébrés, les stéroïdes sexuels, qui sont principalement produits par les gonds, jouent un rôle important dans la régulation de l’axe cerveau-hypophyse-gonadique (BPG) à travers divers mécanismes de rétroaction^1,2,3,4,5. En outre, les stéroïdes sexuels affectent la prolifération et l’activité des neurones dans le cerveau^6,7,8 et les cellules endocriniennes, y compris les gonadotrophes, dans l’hypophyse^9,10, et jouent ainsi un rôle crucial dans la plasticité cérébrale et hypophysaire. Malgré des connaissances relativement bonnes chez les mammifères, le mécanisme de régulation de l’axe BPG médié par les stéroïdes sexuels est loin d’être compris chez les espèces non mammifères, ce qui conduit à une mauvaise compréhension des principes évolutifs conservés¹¹. Il existe encore un nombre limité d’études documentant le rôle des stéroïdes sexuels sur la plasticité cérébrale et hypophysaire, ce qui soulève la nécessité d’études plus approfondies sur le rôle et les effets des stéroïdes sexuels sur diverses espèces de vertébrés.

Chez les vertébrés, les téléostéens sont devenus de puissants animaux modèles en abordant de nombreuses questions biologiques et physiologiques, notamment la réponse au stress^12,13,la croissance^14,15,la physiologie nutritionnelle^16,17 et la reproduction^2. Les téléostéens, dans lesquels les stéroïdes sexuels sont principalement représentés par l’œstradiol (E2) chez les femelles et la 11-cétotestostérone (11-KT) chez les mâles^18,19, sont depuis longtemps des modèles expérimentaux fiables pour étudier le principe général de la reproduction entre les espèces. Les téléostéens montrent un caractère unique dans leur connexion hypothalamo-hypophysaire^20,21 et leurs cellules gonadotrophes distinctes^22,qui sont parfois pratiques pour l’élucidation des mécanismes de régulation. De plus, en raison de leur aptitude aux expériences en laboratoire et sur le terrain, les téléostéens offrent de nombreux avantages par rapport à d’autres organismes. Ils sont relativement peu coûteux à l’achat et à^{l’entretien23},²⁴. En particulier, les petits modèles de téléostéens tels que le poisson-zèbre (Danio rerio) et le medaka japonais (Oryzias latipes), sont des espèces à très forte fécondité et à cycle de vie relativement court permettant une analyse rapide de la fonction des gènes et des mécanismes pathologiques²³, offrant ainsi des avantages encore plus grands pour répondre à une pléthore de questions biologiques et physiologiques, compte tenu des nombreux protocoles bien développés et de la boîte à outils génétique disponible pour ces espèces²⁵.

Dans de nombreuses études, l’élimination des gonacées (gonadectomie) ainsi que les techniques de prélèvement sanguin ont été utilisées comme méthode pour étudier de nombreuses questions physiologiques, y compris son impact sur la physiologie de la reproduction des vertébrés chez les mammifères^26,27,28,les oiseaux²⁹ et les amphibiens³⁰. Bien que l’effet de la gondectomie sur la physiologie de la reproduction puisse être imité alternativement par les antagonistes des stéroïdes sexuels, tels que le tamoxifène et le clomifène, l’effet des médicaments semble être incohérent en raison des effets bimodinaux^31,32. L’exposition chronique à un antagoniste des stéroïdes sexuels peut entraîner une hypertrophie ovarienne^33,34, ce qui peut désactiver l’observation de ses effets à long terme en raison d’un phénotype malsain. En outre, il est impossible d’effectuer une expérience de récupération après un traitement antagoniste des stéroïdes sexuels, pour justifier l’effet spécifique de certains stéroïdes sexuels. En plus de ces points susmentionnés, d’autres compromis de l’utilisation d’antagonistes de stéroïdes sexuels ont été largement examinés^31,32. Par conséquent, la gonadectomie apparaît encore aujourd’hui comme une technique puissante pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels.

Alors que les techniques de gonadectomie et de prélèvement sanguin sont relativement faciles à réaliser chez les espèces plus grandes, telles que le bar européen (Dicentrarchus labrax)³⁵, le labre à tête bleue (Thalassoma bifasciatum)³⁶, l’aiguillat commun (Scyliorhinus canicula)³⁷ et le poisson-chat (Heteropneustes fossilis et Clarias bathracus)^38,39, ils soulèvent des défis lorsqu’ils sont appliqués dans de petits poissons comme medaka. Par exemple, l’utilisation du système d’administration d’anesthésie pour poissons (FADS)⁴⁰ est moins réalisable et semble sujette à des dommages physiques excessifs pour les petits poissons. En outre, une procédure de gonadectomie couramment utilisée pour les gros poissons⁴⁰ ne convient pas aux petits poissons qui nécessitent une grande précision pour éviter des dommages excessifs. Enfin, le prélèvement sanguin est difficile en raison de l’accès limité aux vaisseaux sanguins et de la petite quantité de sang chez ces animaux. Par conséquent, un protocole clair démontrant chaque étape de la gonadectomie et du prélèvement sanguin dans un petit téléostéen est important.

Ce protocole démontre les procédures étape par étape de la gonadectomie suivie d’un prélèvement sanguin dans le medaka japonais, un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie de l’Est. Les medaka japonais ont un génome séquencé, plusieurs outils moléculaires et génétiques disponibles^25,et un système de détermination génétique du sexe permettant d’enquêter sur les différences sexuelles avant que les caractéristiques sexuelles secondaires ou les gonas ne soient bien développées^41. Fait intéressant, les medaka japonais possèdent des gonnes fusionnées contrairement à de nombreuses autres espèces de téléostéens^42. Ces deux techniques combinées ne prennent que 8 minutes au total et compléteront la liste des protocoles vidéo déjà existants pour cette espèce qui comprenait le labeling des vaisseaux sanguins^43,le patch-clamp sur les sections hypophysaires⁴⁴ et les neurones cérébraux^45,et la culture cellulaire primaire^46. Ces techniques permettront à la communauté de recherche d’étudier et de mieux comprendre les rôles des stéroïdes sexuels dans les mécanismes de rétroaction ainsi que la plasticité cérébrale et hypophysaire à l’avenir.

Protocol

Toutes les expérimentations et manipulations d’animaux ont été menées conformément aux recommandations sur le bien-être des animaux d’expérimentation à l’Université norvégienne des sciences de la vie. Les expériences utilisant la gonadectomie ont été approuvées par l’Autorité norvégienne de sécurité des aliments (FOTS ID 24305). NOTE: Les expériences ont été réalisées en utilisant des hommes et des femmes adultes (âgés de 6 à 7 mois, poids d’environ 0,35 g, …

Representative Results

Ce protocole décrit chaque étape pour effectuer une gonadectomie et un prélèvement sanguin dans un téléostéen modèle de petite taille, le medaka japonais. Le taux de survie du poisson après ovariectomie (OVX) chez les femelles est de 100% (10 poissons sur 10) tandis que 94% (17 sur 18 poissons) des mâles ont survécu après une orchidectomie. Pendant ce temps, après la procédure de prélèvement sanguin, tous les poissons (38 poissons) ont survécu. <p class="jove_content"…

Discussion

Comme indiqué dans la littérature précédente, la gonadectomie et le prélèvement sanguin ont longtemps été utilisés chez d’autres espèces modèles pour étudier les questions liées au rôle des stéroïdes sexuels dans la régulation de l’axe BPG. Cependant, ces techniques ne semblent se prêter qu’aux animaux plus gros. Compte tenu de la petite taille du modèle de téléostéoscé couramment utilisé, le medaka japonais, nous fournissons un protocole détaillé pour la gonadectomie et le prélèvement s…

Materials

Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		–	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry