Gonadectomy och blodprov förfaranden i den lilla storleken Teleost Modell Japanska Medaka (Oryzias latipes)

Summary

Artikeln beskriver ett snabbt protokoll för att gonadectomize och ta prov på blod från den lilla teleostfisken, med hjälp av japanska medaka (Oryzias latipes) som modell, för att undersöka sex steroiders roll i djurfysiologi.

Abstract

Sex steroider, produceras av gonads, spela en viktig roll i hjärnan och hypofysen vävnad plasticitet och i neuroendokrina kontroll av reproduktion i alla ryggradsdjur genom att ge feedback till hjärnan och hypofysen. Teleost fiskar har en högre grad av vävnad plasticitet och variation i reproduktiva strategier jämfört med däggdjur och verkar vara användbara modeller för att undersöka rollen av kön steroider och de mekanismer genom vilka de agerar. Avlägsnandet av den huvudsakliga källan till sex steroid produktion med gonadectomy tillsammans med blodprov för att mäta steroidnivåer har varit väletablerad och ganska genomförbar i större fisk och är en kraftfull teknik för att undersöka rollen och effekterna av sex steroider. Dessa tekniker ger dock upphov till utmaningar när de implementeras i små teleostmodeller. Här beskriver vi steg-för-steg förfarandena av gonadectomy hos både män och kvinnliga japanska medaka följt av blodprov. Dessa protokoll visas vara mycket genomförbara i medaka anges av en hög överlevnad, säkerhet för livslängden och fenotyp av fisken och reproducerbarhet när det gäller kön steroid clearance. Användningen av dessa förfaranden i kombination med de andra fördelarna med att använda denna lilla teleost modell kommer att avsevärt förbättra förståelsen av återkopplingsmekanismer i neuroendokrina kontrollen av reproduktion och vävnad plasticitet som tillhandahålls av kön steroider i ryggradsdjur.

Introduction

Hos ryggradsdjur, kön steroider, som huvudsakligen produceras av gonaderna, spela viktiga roller i regleringen av brain-hypofysen-Gonadal (BPG) axeln genom olika feedback mekanismer^1,2,3,4,5. Dessutom, kön steroider påverkar spridningen och aktiviteten av nervceller i hjärnan^{6,7,8 och}endokrina celler, inklusive gonadotropes, i hypofysen^9,10, och därmed tjäna avgörande roller i hjärnan och hypofysen plasticitet. Trots relativt god kunskap hos däggdjur, mekanismen för BPG axelreglering medierad av kön steroider är långt ifrån förstådd i icke-däggdjur arter, vilket leder till dålig förståelse för evolutionära bevarade principer¹¹. Det finns fortfarande ett begränsat antal studier dokumenterar sex steroiders roll på hjärnan och hypofysen plasticitet, vilket ökar behovet av ytterligare undersökningar av könssteroidernas roll och effekter på olika ryggradsdjur arter.

Bland ryggradsdjur har teleoster blivit kraftfulla modelldjur för att ta itu med många biologiska och fysiologiska frågor, inklusive^{stressrespons 12,13,}tillväxt^14,15,näringsfysiologi^{16,17 och} reproduktion². Teleoster, där könssteroider mestadels representeras av estradiol (E2) hos kvinnor och 11-ketotestosteron (11-KT) hos män^18,19, har länge varit tillförlitliga experimentella modeller för att undersöka den allmänna principen om reproduktion över arter. Teleosts visar unikhet i sin hypotalamus-hypofysen^{anslutning 20,21} och distinkta gonadotrope celler²², som ibland är praktiska för att klargöra regleringsmekanismer. På grund av deras mottaglighet för både laboratorie- och fältexperiment erbjuder teleoster dessutom många fördelar jämfört med andra organismer. De är relativt billiga att köpa och underhålla^23,24. I synnerhet är små teleostmodeller som zebrafisk (Danio rerio) och den japanska medaka (Oryzias latipes), arter med mycket hög fecunditet och en relativt kort livscykel som möjliggör snabb analys av genfunktion och^{sjukdomsmekanismer 23}, vilket ger ännu större fördelar när det gäller att ta itu med en mängd biologiska och fysiologiska frågor, med tanke på de många välutvecklade protokoll och genetiska verktygslåda som finns tillgängliga för dessa arter²⁵.

I många studier har avlägsnandet av gonad (gonadectomy) tillsammans med blodprovtagningstekniker använts som en metod för att undersöka många fysiologiska frågor, inklusive dess inverkan på ryggradsdjur reproduktiv fysiologi hos däggdjur^26,27,28,fåglar²⁹ och amfibier³⁰. Även om gonadectomy effekten på reproduktiv fysiologi kan alternativt efterliknas av kön steroid antagonister, såsom tamoxifen och klonifen, effekten av drogerna verkar vara inkonsekvent på grund av bimodala effekter^31,32. Kronisk exponering för en sex steroid antagonist kan leda till äggstockscancer utvidgningen^33,34, som kan inaktivera observation av dess effekter för långsiktiga ändamål på grund av en ohälsosam fenotyp. Dessutom, Det är omöjligt att utföra ett återhämtningsexperiment efter sex steroid antagonist behandling, att motivera den specifika effekten av vissa kön steroider. Tillsammans med dessa ovannämnda punkter, andra kompromisser av kön steroid antagonist användning har granskats utförligt^31,32. Därför, gonadectomy fortfarande visas idag som en kraftfull teknik för att undersöka rollen av kön steroider.

Medan gonadectomy och blodprovstekniker är relativt lätta att utföra i större arter, såsom europeisk havsabborre (Dicentrarchus labrax)³⁵, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)³⁶, dogfish (Scyliorhinus canicula)³⁷ och havskatt (Heteropneustes fossilis och Clarias bathracus)^38,39, de väcker utmaningar när de appliceras i små fiskar som medka. Till exempel är användningen av Fish Anesthesia Delivery System (FADS)⁴⁰ mindre genomförbar och verkar vara benägen för överdriven fysisk skada för små fiskar. Dessutom är ett gonadectomy förfarande som vanligtvis används för större fisk⁴⁰ inte lämplig för små fiskar som kräver hög precision för att undvika överdriven skada. Slutligen är blodprov utmanande på grund av den begränsade tillgången till blodkärl och den lilla mängden blod hos dessa djur. Därför är ett tydligt protokoll som visar varje steg av gonadectomy och blodprov i en liten teleost av betydelse.

Detta protokoll visar steg-för-steg förfarandena av gonadectomy följt av blodprov i japanska medaka, en liten sötvatten fisk infödda till Östasien. Japanska medaka har ett sekvenserat genom, flera molekylära och genetiska verktyg^{tillgängliga 25}, och ett genetiskt könsbestämningssystem som möjliggör undersökning av sexuella skillnader före sekundära sexuella egenskaper eller gonads är välutvecklade⁴¹. Intressant nog har japansk medaka smälta gonads som strider mot många andra teleostarter⁴². Dessa två tekniker tillsammans tar bara 8 minuter totalt och kommer att slutföra listan över videoprotokoll som redan finns för denna art som inkluderade märkning av^{blodkärl 43}, patchklämma på hypofysen^{avsnitt 44} och hjärnneuroner⁴⁵, och primär cellkultur⁴⁶. Dessa tekniker kommer att göra det möjligt för forskarsamhället att undersöka och bättre förstå könssteroidernas roller i feedbackmekanismer samt hjärnan och hypofysplastik i framtiden.

Protocol

Alla försök och djurhantering genomfördes i enlighet med rekommendationerna om försöksdjurs välbefinnande vid Norges universitet. Försök med gonadektomi godkändes av Den norska myndigheten för livsmedelssäkerhet (FOTS ID 24305). OBS: Experimenten utfördes med vuxna manliga och kvinnliga (6-7 månader gamla, vikt ca 0,35 g, längd ca 2,7 cm) japanska medaka. Könet bestämdes genom att skilja de sekundära sexuella egenskaperna, såsom storleken och formen på dorsal och analfena, s…

Representative Results

Detta protokoll beskriver varje steg för att utföra gonadectomy och blodprov i en liten storlek modell teleost, den japanska medaka. Överlevnadsgraden för fisken efter ovariectomy (OVX) hos kvinnor är 100% (10 av 10 fiskar) medan 94% (17 av 18 fiskar) av hanarna överlevde efter orkidéektomi. Under tiden, efter blodprovet utfördes, överlevde alla (38 fiskar) fiskar. Sham-operated honor visar oviposition (<strong class="x…

Discussion

Som rapporterats i tidigare litteratur, gonadectomy och blodprov har länge använts i andra modellarter för att undersöka frågor relaterade till rollen av kön steroider i reglering av BPG axeln. Dessa tekniker verkar dock vara mottagliga endast för större djur. Med tanke på den lilla storleken på den vanliga teleostmodellen, japansk medaka, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för gonadectomy och blodprov som är genomförbart för denna art.

Det faktum att överlevnadsgraden…

Materials

Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		–	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry