Summary
Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.
Abstract
Zelldurchdringende Peptide (CPPs) sind definiert als Träger, die in der Lage sind, die Plasmamembran zu durchqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen. Eines der wichtigsten gemeinsamen Merkmale, die für diese Aktivität erforderlich sind, ergab sich aus den Wechselwirkungen von CPPs mit der Plasmamembran (Lipide) und insbesondere mit Komponenten der extrazellulären Matrix der Membran selbst (Heparansulfat). Unabhängig von der direkten Translokation oder der endozytoseabhängigen Internalisierung sind Lipiddoppelschichten sowohl auf Der Ebene der Plasmamembran als auch auf der Ebene des intrazellulären Verkehrs (endosomale Vesikel) am Internalisierungsprozess beteiligt. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die verschiedenen Schritte der Formulierung, Reinigung, Charakterisierung und Anwendung eines großen unilamellaren Vesikels (LUVs) beschreibt, um eine mögliche CPP-Membrandestabilisierung / -interaktion zu erkennen und ihre Rolle im Internalisierungsmechanismus zu adressieren. LUVs mit einer Lipidzusammensetzung, die den Plasmamembrangehalt widerspiegelt, werden erzeugt, um sowohl einen Fluoreszenzfarbstoff als auch einen Quencher zu verkapseln. Die Zugabe von Peptiden im extravesikulären Medium und die Induktion von Peptid-Membran-Wechselwirkungen auf den LUVs könnten somit dosisabhängig eine signifikante Erhöhung der Fluoreszenz induzieren, die eine Leckage aufdeckt. Hier werden Beispiele mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen amphipathischen Peptiden (WRAPs) geliefert, die eine schnelle und effiziente siRNA-Abgabe in verschiedenen Zelllinien zeigten. Schließlich werden die Art dieser Wechselwirkungen und die Affinität zu Lipiden diskutiert, um die Membrantranslokation und/oder den endosomalen Entweicher zu verstehen und zu verbessern.
Introduction
Nach ihrer Entdeckung in den neunziger Jahren wurden zelldurchdringende Peptide (CPPs) entwickelt, um eine effiziente zelluläre Lieferung von Ladungen durch die Plasmamembran zu fördern1,2. CPPs sind in der Regel kurze Peptide, im Allgemeinen 8 bis 30 Aminosäuren, die eine Vielzahl von Ursprüngen haben. Sie wurden zunächst als "direkt translozierende" Träger definiert, was bedeutet, dass sie in der Lage waren, die Plasmamembran zu überqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen, unabhängig von einem endozytotischen Weg, weder Energiebedarf noch Rezeptorbeteiligung. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese ersten Beobachtungen hauptsächlich auf eine Fluoreszenzüberschätzung aufgrund des experimentellen Artefakts und/oder auf Fixierungsprotokolle mit Methanol3 zurückzuführen waren. Heutzutage ist es allgemein anerkannt, dass die CPP-Aufnahme sowohl durch Endozytose als auch durch energieunabhängige Translokation4,5,6,7 in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wie der Art der Ladung, der verwendeten Verbindung zwischen CPP und Ladung, der untersuchten Zelllinie usw. erfolgt.
CPPs können als Transfektionsmittel nach zwei Strategien verwendet werden, entweder mit einer chemischen Verbindung (kovalente Strategie) oder elektrostatisch/hydrophobe Wechselwirkungen (nicht-kovalente Strategie) zwischen dem CPP und seiner Ladung8,9,10,11. Obwohl beide Strategien ihre Effizienz beim Zelltransfer mehrerer Ladungen gezeigt haben, ist das Verständnis des Mechanismus der Internalisierung durch CPPs immer noch umstritten und das Gleichgewicht zwischen Endozytosewegen oder direkter Penetration ist immer noch schwer zu messen12,13. Obwohl eine Reihe von experimentellen Werkzeugen und Strategien zur Verfügung stehen, um die Beteiligung endozytärer Prozesse klar zu adressieren, scheint die direkte Translokation jedoch schwieriger zu charakterisieren, da sie diskretere Wechselwirkungen mit Plasmamembrankomponenten impliziert. Biologische Membranen bestehen in der Regel aus zahlreichen Komponenten, von Phospholipiden bis hin zu Membranproteinen, die je nach Zelltyp und/oder Umgebung (Stressbedingungen, Zellteilung usw.) variieren können. Diese Vielfalt der Zusammensetzung und folglich das Fehlen eines universellen zellulären Membranmodells ermöglicht keine Studien in einer einzigen Weise. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden jedoch schrittweise Ansätze mit künstlichen Membranen oder Membranextrakten entwickelt. Von kleinen unilamellaren Vesikeln bis hin zu Monolayer-Ansätzen war jedes Modell eindeutig relevant, um spezifische Fragen zu beantworten14,15. Unter ihnen bilden große unilamellare Vesikel (LUVs) ein geeignetes Membranimitationsmodell, um Peptid/ Membran-Wechselwirkungen als Schlüsselpunkt im Internalisierungsprozess zu untersuchen.
In diesem Zusammenhang beschreibt das folgende Protokoll die Untersuchung der Auswirkungen von Peptiden und Peptid/Membran-Wechselwirkungen auf die Integrität von LUVs durch die Überwachung sowohl eines anionischen Fluoreszenzfarbstoffs als auch seines entsprechenden polykationischen Quenchers, der in Liposomen verkapselt ist. Dieses Tool wird verwendet, um CPP / Membran-Interaktionen zu untersuchen, um zu verstehen, ob sie in der Lage sind, eine direkte Membrantranslokation durchzuführen. Obwohl dieser LUV-Fluoreszenzleckage-Assay normalerweise zum Vergleich verschiedener membranwechselwirkender Peptide angewendet wird, könnte er auch zur Untersuchung von CPPs-Frachtkonjugaten (kovalente Strategie) und CPP:cargo-Komplexen (nicht-kovalente Strategie) verwendet werden.
Das vorliegende Protokoll wird daher erstmals exemplarisch mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen Amphipathischen Peptiden (WRAP)16 veranschaulicht. WRAP ist in der Lage, peptidbasierte Nanopartikel zu bilden, um schnell und effizient kleine interferierende RNA (siRNA) in mehreren Zelllinien zu liefern16. Die Fluoreszenzleckeigenschaften von WRAP-Peptid allein oder siRNA-beladenen WRAP-basierten Nanopartikeln wurden überwacht, um ihren Mechanismus der zellulären Internalisierung zu charakterisieren. Wir zeigten, dass ihr Internalisierungsmechanismus hauptsächlich direkte Translokationbeinhaltete 7. In einem zweiten Beispiel wurde das WRAP-Peptid kovalent mit dem Protein/Protein-interferierenden Peptid iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 konjugiert und seine Fähigkeit, Membranen zu destabilisieren, in einem Fluoreszenzleckage-Assay mit iCAL36 verglichen, das mit Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), einem weiteren CPP, gekoppelt ist.
Abschließend werden die Vorteile und Grenzen der Methode sowohl aus technologischer Sicht als auch im Hinblick auf die biologische Relevanz diskutiert.
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Protocol
1. Vorbereitung großer unilamellarer Vesikel (LUVs)
- Bereiten Sie LUVs für ihre Verwendung als Zellmembran-Nachahmungen für die Fluoreszenzleckage-Assay vor.
- Mischen Sie mit einer Hamilton Glasspritze Phosphatidylcholin (DOPC, 786,11 g/mol), Sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) und Cholesterin (Chol, 386,65 g/mol) im Molverhältnis 4:4:2. Die Lipidlösung wird aus einer Stammlösung jedes Lipids gewonnen, das in einem Methanol/Chloroform-Lösungsmittel (3/1; Volumen/Volumen) bei 25 mg/ml in einem 25-ml-Glas-Rundkolben gelöst ist. Basierend auf 4 μmol DOPC, 4 μmol SM und 2 μmol Chol wird die Lipidlösung aus Stammlösung durch Mischen von 126 μL, 117 μL bzw. 31 μL erhalten.
VORSICHT: Methanol ist ein giftiges und brennbares Lösungsmittel und Chloroform ist giftig und krebserregend. Beide sollten mit dem entsprechenden Schutz unter einer Haube gehandhabt werden. - Methanol/Chloroform mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum während 45-60 min bei 60 °C verdampfen, bis ein getrockneter Lipidfilm entsteht.
- Bereiten Sie zwei HEPES-Pufferlösungen vor. HEPES-Puffer 1 durch Mischen von 20 mM HEPES (238,3 g/mol) und 75 mM NaCl (58,44 g/mol) herstellen und pH-Wert auf 7,4 einstellen. HEPES-Puffer 2 durch Mischen von 20 mM HEPES und 145 mM NaCl vorbereiten und pH-Wert auf 7,4 einstellen. HEPES-Puffer können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Osmolarität der Puffer mit einem Osmometer zu überprüfen. - Herstellung einer Lipidhydratationslösung durch Lösen der Membran undurchlässiger fluoreszierender Farbstoff-Quencher-Paare, 8-Aminonaphthalin-1, 3, 6-Trisulfonsäure, Dinatriumsalz bei 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) und p-Xylol-Bispyridiniumbromid bei 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) in HEPES-Pufferlösung. Das Mischen von AMEISEN mit DPX führt zu einer gelben Lösung. Um die Konzentrationen von 12,5 mM ANTS und 45 mM DPX zu erreichen, lösen Sie 21,4 mg bzw. 76 mg in 4 ml HEPES-Puffer 1 auf.
HINWEIS: Lipidhydratationslösung kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden, indem das Röhrchen mit Aluminiumfolie umwickelt wird. - Rekonstituieren Sie mehrschalige Vesikel (MLV), indem Sie den getrockneten Lipidfilm mit 1 ml der Lipidhydratationslösung wiederverwenden und bis zur Auflösung des getrockneten Lipidfilms wirbeln. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig gelöst ist, da sich kleine Lipidaggregate negativ auf die vorhergehenden Schritte auswirken. Überprüfen Sie auch die Wand des Glas-Rundkolbens, um sicherzustellen, dass kein Lipidfilm mehr vorhanden ist.
HINWEIS: Die Lösung erscheint nach der Lösung opalisierend und hellgelb. - Unterziehen Sie die Vesikel fünf Gefrier- / Auftauzyklen, um einlamellare Vesikel zu erhalten. Führen Sie jeden Zyklus durch, indem Sie den Glas-Rundkolben für 30 s in flüssigen Stickstoff für den Gefrierschritt stellen und dann für 2 Minuten in einem Wasserbad für den Auftauschritt belassen.
HINWEIS: Die Temperatur des Badewassers sollte 5-10 °C höher sein als die Schmelztemperatur der Lipide. - Bereiten Sie den Lipidextruder vor, indem Sie zwei Filterträger mit HEPES-Puffer in jedes Polytetrafluorethylen (PTFE) -Extruderstück einsetzen, das in den Metallextruderkanister gelegt wird.
- Legen Sie eine HEPES-befeuchtete Polycarbonatmembran (0,1 μm Porengröße, 25 mm Durchmesser) auf die Oberseite einer Filterhalterung.
- Montieren Sie die beiden Metallextruderkanister und schrauben Sie sie.
- Legen Sie den zusammengebauten Extruder in den Halter und führen Sie eine 1-ml-Spritze in das entsprechende Loch am Ende jedes Polytetrafluorethylen-Extruderstücks ein. Die Extrusion entspricht dem Durchgang der getesteten Flüssigkeit von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran.
- Testen Sie den Extruder mit 1 ml HEPES-Puffer, der in eine der 1 ml Spritzen geladen ist, um sicherzustellen, dass keine Leckagen oder Probleme auftreten.
- Ersetzen Sie den 1-ml-HEPES-Puffer durch die MLV-Probe.
- Führen Sie die Extrusion durch, indem Sie die MLV-Probe mindestens 21 Mal von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran leiten, um einheitliche LUVs gleicher Größe zu erhalten.
HINWEIS: Die Extrusion sollte bei einer Temperatur erfolgen, die höher ist als die Schmelztemperatur des Lipidgemisches.
2. Reinigung von LUVs
- Bereiten Sie eine Säulenreinigung vor, um nicht gekapselte ANTS- und DPX-Überschuss zu entfernen.
- Vernetztes Dextrangel (G-50), das in wässrigem Medium mit 0,01%NaN3 (65 g/mol) resuspendiert ist, in eine Flüssigkeitschromatographiesäule (Luer Lock, nicht ummantelt, 1,0 cm x 20 cm, Bettvolumen 16 ml) bis zu 1 cm unter der Oberseite des farblosen Teils der Säule einführen.
- Öffnen Sie den Wasserhahn und lassen Sie die Flüssigkeit fließen, um das vernetzte Dextran-Gel abzusetzen.
- Waschen Sie die Säule durch Eluieren mit 20 ml HEPES-Puffer 2 und verwerfen Sie den Ausgangsstrom der Säule.
- Schließen Sie den Wasserhahn, sobald das tote Lösungsmittelvolumen über der Säule minimiert ist (<100 μL), aber ausreichend, um eine Trocknung des vernetzten Dextrangels zu vermeiden.
- Legen Sie die frisch extrudierten LUVs (gelb) auf die Säule und lassen Sie sie in das vernetzte Dextran-Gel einwirken.
- Fügen Sie der Säule kontinuierlich den HEPES-Puffer 2 hinzu, um die LUV-Reinigung durchzuführen.
- Elute etwa 2 ml HEPES-Puffer 2 (vergessen Sie nicht, die Oberseite der Säule regelmäßig zu füllen, um ein Trocknen des vernetzten Dextran-Gels zu vermeiden): Die freie gelbe AMEISEN- und DPX-Lösung wandert langsamer als die Liposomen.
- Beginnen Sie mit dem Sammeln von gereinigten LUVs in Röhrchen (1,5 ml).
- Beobachten Sie die Eluententropfen aus der Säule und wenn sie opalisierend werden, enthalten sie Liposomen. Wechseln Sie das Röhrchen, um die LUV-haltige Fraktion zurückzugewinnen.
- Elute, bis die Tropfen nicht mehr opalisierend sind (~1 ml). Eluieren Sie anschließend weitere 0,5 ml in einer separaten Fraktion und hören Sie dann auf zu eluieren.
HINWEIS: Standards sind jetzt in einer Vielzahl von Molekulargewichten, als Kits oder einzelne Molekulargewichte erhältlich, um das Elutionsvolumen der LUVs zu kalibrieren. - Wickeln Sie die Röhrchen mit den LUVs in Aluminiumfolie, um ein Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs zu vermeiden.
- Waschen Sie die Säule mit 20 mL HEPES Puffer 2.
- Die LUVs können dann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden.
HINWEIS: Da die LUV-Stabilität von der LUV-Konzentration und -Zusammensetzung sowie von der Ionenstärke abhängen kann, sollte die Größe der LUVs mit einem DLS-Instrument (Dynamic Light Scattering) gesteuert werden (siehe Abschnitt 4. B. Charakterisierung von LUV-Größe und Homogenität) vor jedem Test.
3. Quantifizierung der Konzentration von LUVs
- Schätzung der LUV-Konzentration durch ein Phospholipid-Quantifizierungskit, das die Bewertung der Cholinkonzentration19ermöglicht. Dieser Assay kann angewendet werden, wenn Phospholipide mit Cholin, das polaren Kopf enthält, erheblich sind (>50% der LUVs).
- Bereiten Sie das Farbreagenz vor, indem Sie 18 mg Chromogensubstrat in 3 ml Puffer auflösen.
- Laden Sie eine Polystyrolküvette, 10 x 10 x 45 mm, mit 3 ml Farbreagenz ein.
- Verwenden Sie das reine Farbreagenz als Leerbedingung (Blank). 20 μL LUV-Probe (Test) oder 20 μL Standardlösung bekannter Cholinkonzentration (Standard) zugeben.
- Gut mischen und 5 min bei 37 °C unter allen Bedingungen (Blank, Test und Standard) inkubieren.
- Messen Sie die Absorption (optische Dichte, OD) der Probe und der Standardlösung mit der Blindlösung als Kontrolle bei 600 nm mit einem Spektralphotometer.
- Überprüfen Sie die OD-Werte, die es ermöglichen, die Lipidkonzentration der LUVs, C [LUV], in Cholinäquivalent im Vergleich zum Standard der bekannten Konzentration abzuschätzen.
- Führen Sie die Berechnung mit der folgenden Gleichung durch:
C[LUV] (mol / l) = (OD-Probe / OD-Standard) x C[Standard] (mol / l)
ANMERKUNG: Das Phospholipid-Quantifizierungskit enthielt eine Cholinchlorid(139,6 mg/l)-Standardlösung bei 54 mg/dl, die der molaren Konzentration von C[Standard] = 3,87 mmol/L entspricht.
4. Charakterisierung von LUV-Größe und Homogenität
- Führen Sie eine Messung mit einem DLS-Gerät durch, um die LUV-Größe (in nm) und den Polydispersitätsindex (PdI) zu bestimmen.
- Programmieren Sie das entsprechende "Standard Operation Procedure" (SOP), indem Sie die Viskosität des Lösungsmittels/Puffers und der verwendeten Küvette angeben.
- 500 μL der LUV-Lösung in eine Polystyrol-Halbmikroküvette geben.
- Setzen Sie die Polystyrol-Semimikroküvette in ein DLS-Gerät ein.
- Messen Sie bei Raumtemperatur die Größenverteilung in Bezug auf die mittlere Größe (Z-Mittelwert) der Partikelverteilung und der Homogenität (Polydispersitätsindex, PdI).
- Alle Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Messungen, die jeweils in drei sich wiederholenden Zyklen durchgeführt werden.
HINWEIS: Die Standardwerte für LUVs betragen eine mittlere Größe von 137 ± 7 nm mit einem PdI von 0,149 ± 0,041.
5. Herstellung von Peptidlösungen
- Bereiten Sie eine Stammlösung des Peptids vor, die für den Leckage-Assay analysiert werden sollte.
- Lösen Sie Peptidpulver (>95% Reinheit) in reinem Wasser auf (z. B. 1 mg Peptid in 500 μL reinem Wasser).
HINWEIS: Es wird empfohlen, Peptide in reinem Wasser zu verdünnen und eine Dimethylsulfoxid (DMSO) -Solubilisierung zu vermeiden, die Artefakte induzieren könnte (z. B. Membranpermeabilisierung20). - Wirbeln Sie die Peptidlösung für 5 s.
- Die Peptidlösung in einem Wasserbeschallungsbad für 5 min beschallen und dann für 5 min bei 12.225 x gzentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand zur Konzentrationsbestimmung.
- Messen Sie die Absorption von drei unabhängigen Peptidverdünnungen bei 280 nm und berechnen Sie dann die Peptidkonzentration anhand des molaren Extinktionskoeffizienten ε (abhängig vom Tryptophan- und Tyrosingehalt in der Peptidsequenz) und der Beer-Lambert-Regel.
HINWEIS: Wenn das Peptid Tryptophan und Tyrosin enthält, wird der molare Extinktionskoeffizient ε auf der Grundlage von Tryptophan ε = 5.690 M-1cm-1 und Tyrosin ε = 1.280 M-1cm-1berechnet. Wenn die Peptidsequenz kein Tryptophan oder Tyrosin enthält, könnte ein anderer kolorimetrischer Assay zur Messung der Konzentration durchgeführt werden (z. B. BCA oder Bradford). - Die Peptidlösung in reinem Wasser auf eine von 100 μM verdünnen und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: In reinem Wasser kommt es während der 4 °C Lagerung zu keinem Peptidabbau. Die Peptidkonzentration sollte jedoch alle 2 Wochen gemessen werden, um sicherzustellen, dass keine Wasserverdunstung auftritt.
6. Fluoreszenz-Leckage-Assay
- Der Fluoreszenzlecktest wird auf einem Spektrofluorometer bei Raumtemperatur gemessen. Anregungs- und Emissionswellenlänge sind auf Ex = 360 nm ± 3 nm bzw. Em = 530 nm ± 5 nm festgelegt.
- Verdünnen Sie LUVs in 1 mL HEPES-Puffer 2 auf eine Endkonzentration von 100 μM in einer Quarzfluoreszenzküvette. Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu, um die Lösung während des Experiments zu homogenisieren.
- Messen Sie die LUVs allein während der ersten 100 s, zwischen t = 0 s und t = 99 s, um auf die Hintergrundfluoreszenz zuzugreifen.
HINWEIS: LUVs allein konnten auch während des gesamten Experiments (15 min) gemessen werden, um auf Hintergrundfluoreszenz und potenzielle Lecks zuzugreifen. - Danach messen Sie die Leckage als Erhöhung der Fluoreszenzintensität unter Zugabe von Aliquots der Peptidlösung für die nächsten 900 s (15 min). Dieses Protokoll wird für jede getestete Peptidkonzentration von 0,1 μM bis 2,5 μM durchgeführt.
- Schließlich wurde eine 100%ige Fluoreszenz durch Solubilisierung der LUVs durch Zugabe von 1 μL Triton X-100 (0,1%, v/v) erreicht, was zu einer völlig ungequenten Sonde zwischen t = 1.000 s und t = 1.100 s führte.
7. Quantifizierung der Leckage
- Unterdrücken Sie Werte, die nach t = 1.090 s erhalten wurden, um die gleiche Anzahl von Punkten für jede getestete Bedingung beizubehalten.
- Berechnen Sie die minimale Fluoreszenz, Fmin, indem Sie den Durchschnitt von 50 Punkten zwischen t = 0 s und t = 49 s (LUVs allein) bilden.
- Berechnen Sie die maximale Fluoreszenz, Fmax, indem Sie den Durchschnitt von 50 Punkten zwischen t = 1.041 s und t = 1.090 s (LUVs mit Triton X-100) bilden.
- Berechnen Sie den Leckageprozentsatz (%Leck) zu jedem Zeitpunkt (t = x) gemäß der folgenden Gleichung:
%Leck(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100 - Berechnen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung für Werte, die mit unterschiedlicher LUV-Vorbereitung (n ≥ 2) für dieselbe Bedingung erhalten wurden.
- Zeichnen Sie den Prozentsatz der Leckage, %Leck(t=x),in Abhängigkeit von der Zeit (n).
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Representative Results
Das Prinzip des Fluoreszenzleckage-Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Detail werden große einlamellare Vesikel (LUVs), die einen fluoreszierenden Farbstoff und einen Quencher (kein Fluoreszenzsignal) verkapseln, mit dem biomolekularen Wirkstoff behandelt. Durch die Wechselwirkung des Peptids mit Lipidmembranen, die Membranpermeabilität, Reorganisation oder sogar Ruptur implizieren könnte, werden der Fluoreszenzfarbstoff und der Quencher aus den LUVs freigesetzt. Nachfolgende Verdünnungen im Puffer führen zu einem erhöhten Fluoreszenzsignal.
Obwohl dieses Schema einen Test mit freien Peptiden darstellt, liegt der Vorteil des Systems in der Fähigkeit, auch frachtkonjugierte Peptide, peptidbasierte Nanopartikel oder andere Biopolymere zu testen, die im Verdacht stehen, Lipidmembranen zu destabilisieren. Obwohl eine vorläufige Optimierung des Protokolls insbesondere in Bezug auf die getesteten Moleküle erforderlich ist, könnte dieser Fluoreszenzlecktest auf eine Vielzahl von membranwechselwirkenden Komponenten ausgeweitet werden. Im vorliegenden Protokoll zeigen wir einige Ergebnisse, die mit den CPPs und ihren komplexierten (nicht-kovalente Strategie) oder konjugierten (kovalente Strategie) Formen erzielt wurden. Die folgenden Beispiele implizieren WRAP allein sowie siRNA-beladene WRAP-basierte Nanopartikel und zwei verschiedene Peptidkonjugate (WRAP-iCAL3617 und Penetratin-iCAL36).
Im Hinblick auf die nicht-kovalente Strategie ist in Abbildung 2ein Fluoreszenzleckage-Assay mit Peptiden und mit ihren entsprechenden siRNA-beladenen Nanopartikeln in Gegenwart von LUVs dargestellt. Die Vesikel bestehen aus einer Mischung von DOPC/SM/Chol (4:4:2), die die Plasmamembran reflektiert, wie in Konate et al.21 beschrieben, und werden üblicherweise verwendet, um die Möglichkeit der Lipiddoppelschichtinteraktion und/oder Transduktionseigenschaften von freien WRAP- und WRAP-basierten Nanopartikeln7direkt zu bewerten. In Abwesenheit von Peptiden wird keine Leckage beobachtet (Baseline während der ersten 100 s). Die Zugabe von freiem WRAP auf den LUVs induziert eine signifikante Erhöhung der Fluoreszenz, die eine wichtige LUV-Leckage und ANTS-Freisetzung aufdeckt. Nach 15 min wird bei der verwendeten Konzentration (2,5 μM) des WRAP-Peptids eine Leckage von 67,8% ± 0,4% gegenüber der Triton-Bedingung (Positivkontrolle) erhalten. Zu beachten ist hierbei, dass auch mehrere verschiedene Konzentrationen getestet wurden und einen dosisabhängigen Fluoreszenzanstieg zeigten, der einer dosisabhängigen LUV-Leckageentspricht 7. Im Gegensatz dazu, wenn WRAP in der gleichen Konzentration mit siRNA zu peptidbasierten Nanopartikeln zusammengesetzt wird, ist die Leckage 1,5-fach schwächer (40,5% ± 0,5%) im Vergleich zum freien Peptid (Abbildung 2). Ähnliche Leckagewerte wurden für das RICK-Peptid (60%) oder die RICK:siRNA-Nanopartikel (28%)22berichtet. Der Unterschied in den Werten zwischen freiem Peptid im Vergleich zu Nanopartikeln könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass bei der Beschäftigung mit den Nanopartikeln ein wesentlicher Teil des Peptids an direkten Wechselwirkungen mit der siRNA beteiligt ist, wodurch die Peptidverfügbarkeit für Wechselwirkungen mit Lipiden verringert wird.
Hinsichtlich der kovalenten Strategie sind fluoreszenzleckage-Assays mit CPP-Konjugaten in Gegenwart von LUVs in Abbildung 3 dargestellt. Bei gleicher LUV-Zusammensetzung [DOPC/SM/Chol (4:4:2)] werden zwei konjugierte Peptide appliziert: WRAP-iCAL36 und Penetratin-iCAL36. Wie bereits erwähnt, wird in Abwesenheit von Peptiden keine Leckage beobachtet. 15 min nach Injektion von 2,5 μM Penetratin-iCAL36 wird kein signifikanter Fluoreszenzanstieg festgestellt (2,3% ± 0,7%), während eine Zugabe von 2,5 μM WRAP-iCAL36 eine Nettoleckage induziert, die durch ein sehr starkes Fluoreszenzsignal (85,8% ± 11,1%) gekennzeichnet ist17. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass bei einigen Peptiden oder Konjugaten keine Fluoreszenzleckage auftreten kann, was auf keine Peptid/Membran-Wechselwirkungen oder keine Lipiddoppelschichtstörung hindeutet. Dies steht im Einklang mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen, die zeigen, dass sowohl Penetratin als auch Tat nicht in der Lage waren, die Membranen23,24,25zu destabilisieren. Es sollte hervorgehoben werden, dass sich die Membrandestabilisierungseigenschaften eines CPP in Abhängigkeit von der gekoppelten Ladung ändernkönnen 26.
Obwohl WRAP-iCAL36 eine starke Leckage verursachte, zeigen zusätzliche Studien keine spezifische zelluläre Internalisierung, was darauf hindeutet, dass diese Konjugate in der Lipiddoppelschicht der Plasmamembran17verblieben sind. Im Gegensatz zum WRAP-Nanopartikel nehmen wir an, dass das WRAP-Cargo-Konjugat in der Lage ist, die LUV-Membran zu destabilisieren, indem es zwischen den Lipidketten klebt oder Poren bildet.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Fluoreszenzlecktest die Fähigkeit einiger CPPs aufdecken könnte, Peptid/Membran-Wechselwirkungen zu entwickeln, was zu einer mehr oder weniger ausgeprägten Membranpermeabilität führen könnte. Darüber hinaus können diese Wechselwirkungen unabhängig von der Strategie der Ladungslieferung (Nanopartikel versus Konjugate) auftreten. Umgekehrt unterscheidet diese Methode nicht, ob ein CPP, das keine Fluoreszenzleckage induziert, noch mit der Doppelschicht oder der biologischen Membran der Lipide interagieren könnte. Diese Art von Verhalten erfordert zusätzliche Ansätze wie Zeta-Potential-Messungen, FRET zwischen Peptid und Membran oder Tryptophan-Fluoreszenzexperimente, um nur einige Beispiele zu nennen.
Abbildung 1: Prinzip des Fluoreszenzlecktestes. LUVs wurden mit einem Fluoreszenzfarbstoff (ANTS) in Weiß und dem entsprechenden Quencher (DPX) in Grau beladen. In Abwesenheit von Peptiden (in rot) wurde kein Fluoreszenzsignal beobachtet, da die ANTS-Fluoreszenz durch DPX gelöscht wurde. Die Zugabe von Peptiden auf den LUVs induzierte die Membranpermeabilität und die anschließende Freisetzung von ANTS und DPX, was zu einem signifikanten Anstieg der ANTS-Fluoreszenz (gelb) führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fluoreszenzlecktest mit freien WRAP- und WRAP:siRNA-Nanopartikeln. Peptid allein und siRNA-beladene Nanopartikel wurden auf LUVs bei der Peptidkonzentration von 2,5 μM aufgebracht. WRAP-basierte Nanopartikel wurden in einem Peptid:siRNA-Molarenverhältnis von 20 (R20) formuliert, wie in Konate et al.7,16beschrieben. Schwarze Pfeile zeigen Injektionen von Peptid (Nanopartikel) bzw. Triton X-100. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fluoreszenz-Leckage-Assay mit WRAP-iCAL36- und Penetratin-iCAL36-Konjugaten. Konjugate wurden auf LUVs in der Konzentration von 2,5 μM aufgebracht. Schwarze Pfeile zeigen Injektionen von Peptid bzw. Triton X-100. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der vorgestellte Fluoreszenzlecktest ist eine einfache und schnelle Methode zur Behandlung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid. Einfach zu machen, ermöglicht es auch einen indirekten Vergleich zwischen verschiedenen membranwechselwirkenden Peptiden oder anderen membraninteragierenden Molekülen. In Bezug auf kritische Schritte des Protokolls, da dieser Assay relative Werte zwischen der Baseline (LUVs allein) und der maximalen Fluoreszenzfreisetzung (Triton-Bedingung) liefert, bewerten wir normalerweise die Konzentration von LUVs mit dem Phospholipid-Quantifizierungskit, das nur den Cholinbeitrag der LUVs schätzt. Es ist jedoch auch möglich, eine genauere Messung der LUV-Konzentration einzubeziehen, indem der Gesamtphosphorgehalt durch Säureaufschluss bestimmt wird, wie von Rouser und Kollegen27 oder von Bartlett28 beschrieben, oder durch kolorimetrische Methode unter Verwendung von Ammoniumfer ferrothiocyanatkomplexierenden Phospholipiden29. In unseren Händen hat es keinen Einfluss auf die relative Quantifizierung der Leckage und auf den Vergleich zwischen membranwechselwirkenden Peptiden.
In Bezug auf die Verwendung von LUVs sollte man auch beachten, wie wichtig es ist, den Zustand der Basislinie von LUV allein zu kontrollieren, um zu überprüfen, ob sie verwendbar sind und ob sie bereits Leckagen aufweisen (gekennzeichnet durch einen kontinuierlichen Anstieg der Fluoreszenz). Ebenso ist es wichtig, die maximale Fluoreszenzfreisetzung nach jeder Peptidinkubation zu messen, um sicherzustellen, dass keine falsch-negativen Ergebnisse aufgrund eines unerwünschten Abschreckprozesses (z. B. Peptid-/Farbstoffabschreckung) aufgezeichnet wurden.
Im Allgemeinen sind LUVs laut DLS-Charakterisierung für 1 Woche ziemlich stabil und sollten keinen zu hohen Fluoreszenzhintergrund aufweisen. In diesem Zusammenhang ist auch die Reinigung von ANTS/DPX-beladenen Liposomen durch Gelfiltration ein Schlüsselpunkt, da die Bildung von LUVs ohne Restfluoreszenz ermöglicht wird, die zum Hintergrund beitragen oder eine Fluoreszenzüberschätzung erzeugen könnte. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, das Protokoll zu kalibrieren, indem eine spezifische Positivkontrolle integriert wird, die immer den gleichen Leckageprozentsatz ergeben kann. Dies stellt eine interne Kontrolle durch die verschiedenen Messungen dar, die die Charakterisierung der LUVs für jeden Test verstärken und die Statistik erhöhen könnte.
Obwohl der Fluoreszenzlecktest einen schnellen Vergleich der Membrandestabilisierung durch CPPs ermöglichen könnte, ist er jedoch in der Interpretation von Peptid-Membran-Wechselwirkungen begrenzt, da einige Peptide in der Lage sind, mit Lipiddoppelschichten zu interagieren, ohne Membranstörungen oder Leckagen hervorzurufen. Für diese Peptide wird dringend empfohlen, zusätzliche Experimente mit spezifischen Fluoreszenzmarkern zu verwenden, die FRET30ermöglichen.
Es sollte auch beachtet werden, dass andere Fluoreszenzfarbstoff/Quencher-Paare (z. B. Tb3+/ DPA31)verwendet werden könnten. Beide Methoden haben ihre Unannehmlichkeiten: Terbium (III) ist nicht sehr wasserlöslich und kann nicht in Gegenwart von Phosphat verwendet werden, während das ANTS-Abschrecken keine lineare Funktion der DPX-Konzentration ist. Darüber hinaus könnten andere selbstabschreckende Materialien wie 70 mM Calceinlösung32 oder Dextran-PTS33 in Abhängigkeit von den Membrandefekten, die durch das analysierte Peptid oder die analysierte Verbindung hervorgerufen werden, gehandhabt werden.
Schließlich ist der Hauptvorteil dieses Fluoreszenzleckage-Assays die Fähigkeit, eine Vielzahl potenzieller membranwechselwirkender Moleküle sowie verschiedene Membranzusammensetzungen zu testen, wie z. B. endosomale Membrannachahmungen [z. B. Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) / Dioleoyl-Phospha-Tidylethanolamin (DOPE) / Phosphatidylinositol aus Sojabohnen (PI) / Bis (Monooleoylglycero) -Phosphat (LBPA) in einem molaren Verhältnis von 5: 2: 1: 2]34 , mitochondriale Membran ahmt [z. B. 46,5% DOPC, 28,5% Phosphatidylethanolamin (PE), 9% Phosphatidylinositol (PI), 9% Phosphatidylserin (PS) und 7% Cardiolipin (CL)35 oder jede andere gewünschte Lipiddoppelschichtzusammensetzung nach. Allerdings muss man zunächst die Stabilität der Vesikel (keine LUV-Fusion, Aggregation oder Ausfällung, kein Lipidabfall aus der Suspension, keine negative Membrankrümmung usw.) mit einer konstanten mittleren Größe nahe 100 nm während des Experiments und der Lagerung sicherstellen.
Darüber hinaus ist der Vorteil dieser Methode gegenüber extrahierten Membranen (rote Blutkörperchen, Mitochondrien usw.) die Verwendung von gereinigten, gut charakterisierten Lipiden in Abwesenheit von Proteinen. Die Kontrolle der Lipiddoppelschichtzusammensetzung (Plasma, endosomale oder mitochondriale Membran) ermöglicht auch die Insertion spezifischer Membranproteine (Protonenpumpe). Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, sowohl interne als auch externe Umgebungen von LUVs zu kontrollieren, eine klare Interpretation von Membranstörungen / Leckagen. Im Vergleich zu Schwarz-Lipid-Membranexperimenten36, die auch Membranpermeabilisierungsereignisse visualisieren können, bietet dieses Leckageprotokoll eine einfachere Screening-Methode von membranaktiven Peptiden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese einfache Methode eine schnelle Identifizierung starker Peptid/Membran-Wechselwirkungen begünstigt, die zu einer Membrandestabilisierung führen. Es kann angewendet werden, um den Mechanismus der Internalisierung von CPPs und in einem allgemeineren Ansatz von "membranaktiven Peptiden" wie fusiogenen oder antimikrobiellen Peptiden zu untersuchen.
Im Allgemeinen ist die Charakterisierung des Hauptweges, der von CPPs verwendet wird, um das Zytoplasma zu erreichen, sehr komplex und erfordert mehrere unterschiedliche Ansätze, von der Biophysik bis zur Zellbiologie. Zum Beispiel ergab die Untersuchung der WRAP-Internalisierung ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen Mechanismen, um in die Zellen einzudringen (Endozytose versus direkte Translokation), und der Fluoreszenzlecktest, der mit anderen Methoden assoziiert ist, hat dazu beigetragen, einen direkten Penetrationsprozess zu unterstützen7.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Emilie Josse für die kritische Begutachtung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Stiftung "La Ligue contre le Cancer", der "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" und dem "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
References
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