Ensaio de vazamento fluorescente para investigar desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células
Summary
O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.
Abstract
Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são definidos como portadores capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para as células. Uma das principais características comuns necessárias para esta atividade resultou das interações de CPPs com a membrana plasmática (lipídios) e mais particularmente com componentes da matriz extracelular da própria membrana (sulfato heparan). De fato, independente da translocação direta ou da internalização dependente da endócita, bicamadas lipídicas estão envolvidas no processo de internalização tanto no nível da membrana plasmática quanto no nível de tráfego intracelular (vesículas endossomais). Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo as diferentes etapas de uma grande formulação de vesículas unilamellar (LUVs) formulação, purificação, caracterização e aplicação no ensaio de vazamento de fluorescência, a fim de detectar possível desestabilização/interação da membrana CPP e abordar seu papel no mecanismo de internalização. LUVs com uma composição lipídica refletindo o teor da membrana plasmática são gerados a fim de encapsular tanto um corante fluorescente quanto um saciador. A adição de peptídeos no meio extravesicular e a indução de interações peptídeo-membrana nos LUVs podem, assim, induzir de forma dependente de dose um aumento significativo da fluorescência revelando um vazamento. Exemplos são fornecidos aqui com o recém-desenvolvido triptofano (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAPs), que mostraram uma entrega rápida e eficiente de siRNA em várias linhas celulares. Finalmente, discute-se a natureza dessas interações e a afinidade com os lipídios para entender e melhorar a translocação da membrana e/ou a fuga endossomal.
Introduction
Após sua descoberta nos anos noventa, peptídeos penetrantes por células (CPPs) foram desenvolvidos para promover uma entrega celular eficiente de cargas através da membrana plasmática1,2. CpPs são geralmente peptídeos curtos, geralmente de 8 a 30 aminoácidos, tendo uma grande variedade de origens. Eles foram definidos pela primeira vez como portadores de “translocação direta”, o que significa que eles foram capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para células independentemente de qualquer via endocítica, nem exigência de energia nem envolvimento receptor. No entanto, investigações posteriores revelaram que essas primeiras observações vieram principalmente da superestimação da fluorescência devido ao artefato experimental e/ou aos protocolos de fixação usando metanol3. Atualmente, é amplamente aceito que a captação de CPP ocorra tanto pela endocitose quanto pela translocação independente de energia4,5,6,7 dependendo de diferentes parâmetros como a natureza da carga, o elo utilizado entre CPP e carga, a linha celular estudada, etc.
As CPPs podem ser utilizadas como agentes de transfecção de acordo com duas estratégias, envolvendo uma ligação química (estratégia covalente) ou interações eletrostáticas/hidrofóbicas (estratégia não covalente) entre o CPP e sua carga8,9,10,11. Embora ambas as estratégias tenham demonstrado sua eficiência na transferência celular de várias cargas, o entendimento do mecanismo de internalização pelas CPPs ainda está sob controvérsia e o equilíbrio entre vias de endocitose ou penetração direta ainda é difícil de medir12,13. Embora um conjunto de ferramentas e estratégias experimentais estejam disponíveis para abordar claramente o envolvimento de processos endocíticos, a translocação direta parece, no entanto, mais difícil de caracterizar, pois implica interações mais discretas com componentes da membrana plasmática. As membranas biológicas são geralmente compostas de inúmeros componentes, desde fosfolipídios até proteínas de membrana, que podem variar de acordo com o tipo celular e/ou o ambiente (condições de estresse, divisão celular, etc.). Essa diversidade de composição e, consequentemente, a ausência de um modelo universal de membrana celular não permite estudos de uma única forma. No entanto, para contornar essas limitações, foram desenvolvidas abordagens passo a passo com extratos artificiais de membrana ou membrana. Desde pequenas vesículas unilamellar até abordagens de monocamadas, cada modelo era claramente pertinente para responder a perguntas específicas14,15. Entre elas, as grandes vesículas unilamellar (LUVs) constituem um modelo de imitação de membrana adequada para estudar as interações peptídeo/membrana como um ponto-chave no processo de internalização.
Neste contexto, o protocolo a seguir descreve a investigação dos efeitos dos peptídeos e interações peptídeo/membrana na integridade luvs através do monitoramento de um corante fluorescente aniônico e seu correspondente quencher poli-cártalico encapsulado em lipossomos. Esta ferramenta é usada para estudar interações CPP/membrana, a fim de entender se elas são capazes de realizar uma translocação direta de membrana. Embora geralmente aplicado para comparar diferentes peptídeos que interagem por membrana, este ensaio de vazamento de fluorescência LUV também pode ser usado para investigar tanto conjugados CPPs-carga (estratégia covalente) quanto complexos de carga CPP (estratégia não covalente).
O presente protocolo será, portanto, exemplificado pela primeira vez com o triptofano recentemente desenvolvido (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAP)16. O WRAP é capaz de formar nanopartículas baseadas em peptídeos para fornecer de forma rápida e eficiente RNA (siRNA) em várias linhas celulares16. As propriedades de vazamento de fluorescência apenas do peptídeo WRAP ou nanopartículas baseadas em WRAP carregadas de siRNA foram monitoradas para caracterizar seu mecanismo de internalização celular. Mostramos que seu mecanismo de internalização envolvia principalmente a translocação direta7. Em um segundo exemplo, o peptídeo WRAP foi covalentemente conjugado ao peptídeo de interfertídeo iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 e sua capacidade de desestabilizar membranas foi comparada em um ensaio de vazamento de fluorescência ao iCAL36 acoplado à Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), outra CPP.
Por fim, serão discutidas as vantagens e limitações do método tanto do ponto de vista tecnológico quanto no que diz respeito à relevância biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de vazamento de fluorescência apresentado é um método simples e rápido para lidar com a desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células. Fácil de fazer, também permite uma comparação indireta entre diferentes peptídeos que interagem por membrana ou outras moléculas que interagem por membrana. Quanto às etapas críticas do protocolo, uma vez que este ensaio fornece valores relativos entre a linha de base (SOMENTE LUVs) e a liberação de fluorescência máxima (condição triton), g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Emilie Josse pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela fundação “La Ligue contre le Cancer”, a “Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer”, e o “Centre National de la Recherche Scientifique” (CNRS).
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
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