Samling og drift af en acoustofluidic enhed til forbedret levering af molekylære forbindelser til celler
Summary
Denne protokol beskriver samling og drift af en billig acoustofluidic enhed til hurtig molekylær levering til celler via sonoporation induceret af ultralyd kontrast agenter.
Abstract
Effektiv intracellulær levering af biomolekyler er nødvendig for en bred vifte af biomedicinsk forskning og cellebaserede terapeutiske anvendelser. Ultralyd-medieret sonoporation er en ny teknik til hurtig intracellulær levering af biomolekyler. Sonoporation opstår, når kavitation af gasfyldte mikrobobler danner forbigående porer i nærliggende cellemembraner, hvilket muliggør hurtig optagelse af biomolekyler fra den omgivende væske. Nuværende teknikker til in vitro sonoporation af celler i suspension er begrænset af langsom gennemløb, variation i ultralyd eksponering betingelser for hver celle, og høje omkostninger. For at løse disse begrænsninger er der udviklet en billig acoustofluidic enhed, som integrerer en ultralydtransducer i en PDMS-baseret fluidic enhed for at fremkalde konsekvent sonoporation af celler, når de strømmer gennem kanalerne i kombination med ultralydkontraststoffer. Enheden fremstilles ved hjælp af standard fotolitografiteknikker til fremstilling af den PDMS-baserede fluidic chip. En ultralyd piezo disk transducer er knyttet til enheden og drevet af en mikrocontroller. Samlingen kan integreres i en 3D-printet kasse for ekstra beskyttelse. Celler og mikrobobler skubbes gennem enheden ved hjælp af en sprøjtepumpe eller en peristaltisk pumpe, der er forbundet til PVC-slanger. Forbedret levering af biomolekyler til humane T-celler og lungekræftceller demonstreres med dette acoustofluidic system. Sammenlignet med bulkbehandlingsmetoder øger dette acoustofluidic system gennemstrømningen og reducerer variationen, hvilket kan forbedre cellebehandlingsmetoder til biomedicinske forskningsformål og fremstilling af cellebaseret terapi.
Introduction
Virale og ikke-virale platforme er blevet brugt til at forbedre molekylær levering til celler. Viral levering (transduktion) er en almindelig teknik, der anvendes i cellebaserede terapier, der kræver genomisk modifikation. Begrænsninger med viral levering omfatter potentiel insertional mutagenesis, begrænset transgen kapacitet og uønsket mangfoldighed af infektion1,2. Derfor er ikke-virale molekylære leveringsteknikker under udvikling til en bred vifte af biomedicinske og forskningsmæssige anvendelser. Almindelige teknikker omfatter mekaniske, elektriske, hydrodynamiske, eller brugen af laser-baseret energi til at øge optagelsen af biomolekyler i celler 3. Elektroporation er en almindeligt anvendt ikke-viral molekylær leveringsplatform, som har evnen til at fremkalde forbigående perforering i plasmamembranen til intracellulær levering af molekylære forbindelser4,5,6,7,8,9. Den forbigående perforering af plasmamembranen er imidlertid en stokastisk proces, og molekylær optagelse via elektroporation er generelt afhængig af passiv diffusion på tværs af de forbigående membranporer4,7,8.
En alternativ metode er brugen af ultralyd til forbedret intracellulær molekylær levering via kavitation af ultralydkontrastmidler (dvs. gasfyldte mikrobobler). Mikrobubble cavitation fremkalder mikrostrømseffekter i de omgivende medier, som kan forårsage forbigående perforering af nærliggende plasmamembraner (“sonoporation”), hvilket muliggør hurtig intracellulær optagelse af biomolekyler via passive eller aktive transportmekanismer10,11,12. Sonoporation er en effektiv teknik til hurtig molekylær levering til celler, men denne tilgang kræver ofte dyrt udstyr og bulkbehandlingsmetoder, som er begrænset af lavere gennemløb og højere variation i ultralydseksponeringsbetingelser13. For at løse disse begrænsninger er acoustofluidic enheder, som muliggør konsekvent sonoporation af celler i suspension, i øjeblikket under udvikling.
Acoustofluidics er et ekspanderende felt, der integrerer ultralyd og mikrofluidiske teknologier til en lang række applikationer. Denne fremgangsmåde har tidligere været anvendt til partikelseparation ved at anvende kontinuerlig ultralydsenergi til at fremkalde stående akustiske bølger i de fluidiske kanaler14,15,16,17. Partikler sorteres mod forskellige dele af enheden baseret på en række egenskaber, f.eks. Acoustofluidic teknologier er også under udvikling for at muliggøre hurtig molekylær levering til en række celletyper til forskningsapplikationer og fremstilling af celleterapier18. For nylig demonstrerede vi forbedret molekylær levering til erythrocytter ved hjælp af en PDMS-baseret acoustofluidic enhed19. I acoustofluidic platform, celle og mikroboble dynamik kan manipuleres til at fremkalde fysiske interaktioner, der muliggør øget levering af biomolekyler. Effektiviteten og konsistensen af intracellulær molekylær levering kan potentielt øges ved at optimere afstanden mellem celler og mikrobobler.
En vigtig ansøgning om encoustofluidic-medieret sonoporation indebærer transport af biomolekyler i primære menneskelige T-celler. Immunterapier baseret på adoptiv T-celleoverførsel, såsom Chimeric Antigen Receptor T-celle (CAR T) terapi, er hurtigt ved at opstå til behandling af forskellige sygdomme, herunder kræft og vira som HIV20. CAR T terapi har været særligt effektiv i pædiatrisk akut lymfoblastisk leukæmi (ALL) patienter, med fuldstændig remission på 70-90%21. Men, T celle fremstilling for disse behandlinger generelt afhænger af viral transduktion, som er begrænset af potentielle insertional mutagenesis, lange behandlingstider, og udfordringer med at levere ikke-genetiske biomolekyler såsom proteiner eller små molekyler1. Acoustofluidic-medierede molekylære leveringsmetoder kan potentielt overvinde disse begrænsninger og forbedre fremstillingen af T-celleterapier.
En anden vigtig anvendelse for acoustofluidic-medieret sonoporation indebærer intracellulær levering af konserveringsmidler forbindelser, såsom trehalose, som beskytter celler under frysning og udtørring. Trehalose produceres af nogle organismer i naturen og hjælper dem med at tolerere frysning og udtørring ved at beskytte deres cellulære membraner22,23. Trehalose produceres imidlertid ikke af pattedyrceller og er uigennemtrængelig for pattedyrscellemembraner. Derfor er effektive molekylære leveringsteknikker, såsom sonoporation, nødvendige for at opnå tilstrækkelige intracellulære trehaloseniveauer, der kræves for at beskytte interne cellulære membraner. Denne tilgang er i øjeblikket under udvikling for tør konservering af forskellige celletyper.
Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af samling og drift af et relativt billigt acoustofluidic system drevet af en mikrocontroller. Ultralyd kontrast agenter udnyttes til at fremkalde sonoporation inden for de fluidiske kanaler og muliggøre hurtig molekylær levering til forskellige celletyper, herunder T-celler og kræftceller. Dette acoustofluidic system kan bruges til en række forskellige forskningsapplikationer og kan også være nyttigt som et prototypesystem til evaluering af sonoporationsmetoder til forbedrede fremstillingsprocesser for celleterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver samling og drift af et billigt acoustofluidic system, der forbedrer intracellulær levering af biomolekyler til forskningsformål. Der er flere vigtige faktorer at overveje, når du samler og bruger dette system. Den acoustofluidic enhed er fremstillet i PDMS, som er et biokompatibelt materiale, der let kan formes med konsekventkanaldimensioner 27. Enheden kanaler kan skylles med 15 ml 70% ethanolopløsning forud for acoustofluidic behandling for at øge steriliteten, når…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af midler fra National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) og National Institutes of Health (U01HL127518). Fotolithography tjenester blev leveret af University of Louisville Micro / Nano Technology Center.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
