Moleküler Bileşiklerin Hücrelere Daha İyi Teslimi İçin Akostofluidik Bir Cihazın Montajı ve çalışması
Summary
Bu protokol, ultrason kontrast ajanları tarafından indüklenen sonoporasyon yoluyla hücrelere hızlı moleküler teslimat için düşük maliyetli bir akostofluidik cihazın montajını ve çalışmasını açıklar.
Abstract
Çok çeşitli biyomedikal araştırmalar ve hücre bazlı terapötik uygulamalar için biyomoleküllerin verimli hücre içi teslimatı gereklidir. Ultrason aracılı sonoporasyon, biyomoleküllerin hızlı hücre içi doğumu için ortaya çıkan bir tekniktir. Sonoporasyon, gaz dolu mikrobubbles kavitasyon yakındaki hücre zarlarında geçici gözenekler oluşturduğunda ortaya çıkar, bu da biyomoleküllerin çevredeki sıvıdan hızlı bir şekilde alınmasını sağlar. Süspansiyondaki hücrelerin in vitro sonoporasyonu için mevcut teknikler yavaş verim, her hücre için ultrason maruz kalma koşullarında değişkenlik ve yüksek maliyet ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları gidermek için, ultrason kontrast ajanları ile birlikte kanallardan akarken hücrelerin tutarlı sonoporasyonunu teşvik etmek için PDMS tabanlı akışkan bir cihaza ultrason dönüştürücüsü entegre eden düşük maliyetli bir akostofluidik cihaz geliştirilmiştir. Cihaz, PDMS tabanlı akışkan çipi üretmek için standart fotolithografi teknikleri kullanılarak üretilmiştir. Bir ultrason piezo disk dönüştürücü cihaza takılır ve bir mikrodenetleyici tarafından tahrik edilir. Montaj, daha fazla koruma için 3D baskılı bir kasaya entegre edilebilir. Hücreler ve mikrobubbles bir şırınga pompası veya PVC boruya bağlı peristaltik bir pompa kullanılarak cihazdan itilir. Biyomoleküllerin insan T hücrelerine ve akciğer kanseri hücrelerine gelişmiş teslimatı bu akostofluidik sistemle gösterilmiştir. Toplu tedavi yaklaşımları ile karşılaştırıldığında, bu akostofluidik sistem verimi arttırır ve değişkenliği azaltır, bu da biyomedikal araştırma uygulamaları ve hücre bazlı terapötiklerin üretimi için hücre işleme yöntemlerini geliştirebilir.
Introduction
Hücrelere moleküler teslimatı geliştirmek için viral ve viral olmayan platformlar kullanılmıştır. Viral doğum (transdüksiyon), genomik modifikasyon gerektiren hücre bazlı tedavilerde kullanılan yaygın bir tekniktir. Viral doğumla ilgili sınırlamalar potansiyel eklemeli mutajensis, sınırlı transgenik kapasite ve istenmeyen enfeksiyon çokluğu1,2’yiiçerir. Bu nedenle, çok çeşitli biyomedikal ve araştırma uygulamaları için viral olmayan moleküler iletim teknikleri geliştirilmektedir. Yaygın teknikler arasında mekanik, elektriksel, hidrodinamik veya biyomoleküllerin hücrelere alımını artırmak için lazer tabanlı enerji kullanımı 3. Elektroporasyon, moleküler bileşiklerin hücre içi teslimatı için plazma zarında geçici perforasyona neden olma yeteneğine sahip yaygın olarak kullanılan viral olmayan moleküler iletim platformudur4, 5,6,7,8,9. Bununla birlikte, plazma zarının geçici perforasyonu stokastik bir işlemdir ve elektroporasyon yoluyla moleküler alım genellikle geçici membran gözenekleri4,7,8boyunca pasif difüzyona bağlıdır.
Alternatif bir yöntem, ultrason kontrast ajanlarının kavitasyonu yoluyla gelişmiş hücre içi moleküler iletim için ultrason kullanımıdır (yani gaz dolu mikrobubbles). Mikrobubble kavitasyon, yakındaki plazma membranlarının (“sonoporation”) geçici perforasyonuna neden olabilen ve pasif veya aktif taşıma mekanizmaları10 , 11,12aracılığıyla biyomoleküllerin hızlı hücre içi alımına izin veren çevre medyada mikro akış etkilerine neden olur. Sonoporasyon hücrelere hızlı moleküler teslimat için etkili bir tekniktir, ancak bu yaklaşım genellikle ultrason maruz kalma koşullarında daha düşük verim ve daha yüksek değişkenlik ile sınırlı olan pahalı ekipman ve toplu tedavi yöntemleri gerektirir13. Bu sınırlamaları gidermek için, süspansiyondaki hücrelerin tutarlı bir şekilde sonoporasyonunu sağlayan akostofluidik cihazlar şu anda geliştirilmektedir.
Akostofluidikler, çok çeşitli uygulamalar için ultrason ve mikroakışkan teknolojileri entegre eden genişleyen bir alandır. Bu yaklaşım daha önce akışkan kanallar içinde ayakta duran akustik dalgaları teşvik etmek için sürekli ultrason enerjisi uygulanarak partikül ayırma için kullanılmıştır14,15,16,17. Parçacıklar, orta16’yagöre parçacık boyutu, yoğunluk ve sıkıştırılabilirlik gibi çeşitli özelliklere göre cihazın farklı bölümlerine doğru sıralanır. Akostofluidik teknolojiler de araştırma uygulamaları ve hücre tedavilerinin üretimi için çeşitli hücre tiplerine hızlı moleküler teslimat sağlamak için geliştirilmektedir18. Son zamanlarda, PDMS tabanlı bir akostofluidik cihaz kullanarak eritrositlere gelişmiş moleküler teslimat gösterdik19. Akostofluidik platformda, hücre ve mikrobubble dinamikleri, biyomoleküllerin daha iyi sunulmasını sağlayan fiziksel etkileşimleri teşvik etmek için manipüle edilebilir. Hücre içi moleküler teslimatın verimliliği ve tutarlılığı, hücreler ve mikrobubbles arasındaki mesafe optimize edilerek potansiyel olarak artırılabilir.
Akostofluidik aracılı sonoporasyon için önemli bir uygulama, biyomoleküllerin birincil insan T hücrelerine taşınmayı içerir. Chimeric Antijen Reseptör T hücre (CAR T) tedavisi gibi benimsenen T hücre transferine dayanan immünoterapiler, kanser ve HIV20gibi virüsler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisi için hızla ortaya çıkıyor. CAR T tedavisi özellikle pediatrik akut lenfoblastik lösemi (ALL) hastalarında% 70-90 oranında tam remisyon oranları ile etkili olmuştur21. Bununla birlikte, bu tedaviler için T hücre üretimi genellikle potansiyel eklemeli mutajensis, uzun işlem süreleri ve proteinler veya küçük moleküller gibi genetik olmayan biyomoleküllerin teslimi ile sınırlı olan viral transdüksiyona bağlıdır1. Akostofluidik aracılı moleküler iletim yöntemleri potansiyel olarak bu sınırlamaların üstesinden gelebilir ve T hücre tedavilerinin üretimini artırabilir.
Akostofluidik aracılı sonoporasyon için bir diğer önemli uygulama, donma ve kurumdan çıkma sırasında hücreleri koruyan trehaloz gibi koruyucu bileşiklerin hücre içi teslimatını içerir. Trehaloz, doğadaki bazı organizmalar tarafından üretilir ve hücresel zarlarını koruyarak donma ve kararma tolere etmelerine yardımcı olur22,23. Bununla birlikte, trehaloz memeli hücreleri tarafından üretilmez ve memeli hücre zarlarına geçirimsizdir. Bu nedenle, iç hücresel zarları korumak için yeterli hücre içi trehaloz seviyelerine ulaşmak için sonoporasyon gibi etkili moleküler iletim teknikleri gereklidir. Bu yaklaşım şu anda çeşitli hücre tiplerinin kuru korunması için geliştirilmektedir.
Bu protokol, bir mikrodenetleyici tarafından yönlendirilen nispeten düşük maliyetli bir akostofluidik sistemin montajı ve çalışmasının ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Ultrason kontrast ajanları akışkan kanallar içinde sonoporasyon indükleme teşvik etmek ve T hücreleri ve kanser hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine hızlı moleküler teslimat sağlamak için kullanılır. Bu akostofluidik sistem çeşitli araştırma uygulamaları için kullanılabilir ve aynı zamanda geliştirilmiş hücre tedavisi üretim süreçleri için sonoporasyon yöntemlerini değerlendirmek için bir prototip sistem olarak yararlı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, araştırma uygulamaları için biyomoleküllerin hücre içi teslimatını geliştiren düşük maliyetli bir akostofluidik sistemin montajını ve çalışmasını açıklar. Bu sistemi kurarken ve çalıştırırken göz önünde bulundurulacak birkaç önemli faktör vardır. Akostofluidik cihaz, tutarlı kanal boyutları27ile kolayca kalıplanabilen biyouyumlu bir malzeme olan PDMS’de üretilmiştir. Cihaz kanalları, kültürlü hücrelerle çalışırken steriliteyi artırmak i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı (#1827521, #1827521, #1450370) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (U01HL127518) tarafından finanse edildi. Louisville Üniversitesi Mikro/Nano Teknoloji Merkezi tarafından fotolithografi hizmeti verildi.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
