세포에 분자 화합물의 향상된 전달을 위한 부동 유체 장치의 조립 및 작동
Summary
이 프로토콜은 초음파 조영제에 의해 유도된 초음파 조영제에 의해 유도된 초음파 포기화를 통해 세포에 급속한 분자 전달을 위한 저비용 acoustofluidic 장치의 조립 및 작동을 설명합니다.
Abstract
생체 분자의 효율적인 세포 내 전달은 광범위한 생체 의학 연구 및 세포 기반 치료 응용 분야에 필요합니다. 초음파 매개 초음파 매개 초음파 화는 생체 분자의 신속한 세포 내 전달을위한 새로운 기술입니다. 소공증은 가스로 채워진 마이크로 버블의 캐비테이션이 주변 세포막에서 일시적인 모공을 형성할 때 발생하므로 주변 유체에서 생체 분자를 빠르게 섭취할 수 있습니다. 현탁액에서 세포의 체외 초음파 화에 대한 현재 기술은 느린 처리량, 각 세포에 대한 초음파 노출 조건의 가변성 및 높은 비용에 의해 제한됩니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 PDMS 기반 유체 장치에 초음파 트랜스듀서를 통합하여 초음파 조영제와 함께 채널을 통해 흐르는 세포의 일관된 초음파 포화를 유도하는 저비용 acoustofluidic 장치가 개발되었습니다. 이 장치는 PDMS 기반 유체 칩을 생산하기 위해 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 제조됩니다. 초음파 압압 디스크 트랜스듀서는 장치에 부착되어 마이크로 컨트롤러에 의해 구동됩니다. 어셈블리는 추가 보호를 위해 3D 프팅 케이스 내부에 통합할 수 있습니다. 세포와 마이크로버블은 PVC 튜빙에 연결된 주사기 펌프 또는 연동 펌프를 사용하여 장치를 통해 밀어낸다. 인간 T 세포및 폐암 세포에 생체 분자의 향상된 전달은 이 부동 유체 시스템으로 입증됩니다. 대량 처리 접근에 비해, 이 acoustofluidic 시스템은 처리량을 증가하고 가변성을 감소시켜 생물 의학 연구 응용 및 세포 기반 치료제 제조를 위한 세포 처리 방법을 향상시킬 수 있습니다.
Introduction
바이러스 성 및 비 바이러스 플랫폼은 세포에 분자 전달을 향상 시키기 위해 활용 되었습니다. 바이러스 성 전달 (트랜스듀션)은 게놈 변형을 요구하는 세포 기반 치료에 활용되는 일반적인 기술입니다. 바이러스 전달에 대한 제한은 잠재적인 삽입 돌연변이 발생, 제한된 형질 전환 능력 및 감염1,2의원치 않는 복합성을 포함한다. 따라서, 비 바이러스 성 분자 전달 기술은 광범위한 생체 의학 및 연구 응용 분야에 대한 개발 중이다. 일반적인 기술은 기계적, 전기적, 유체 역학, 또는 세포로 생체 분자의 섭취를 향상시키기 위해 레이저 기반 에너지의 사용을 포함한다 3. 전기포레이션은 일반적으로 사용되는 비바이러스 분자 전달 플랫폼으로, 분자 화합물4,5,6,7,8,9의세포내 전달을 위해 혈장 막에서 과도 천공을 유도할 수 있는 능력을 갖는다. 그러나, 플라즈마 멤브레인의 일시적인 천공은 전기포공을 통한 좌식 공정 및 분자 조리량은 일반적으로 과도 막 기공4,7,8을가로지르는 수동 확산에 의존한다.
대안적 방법은 초음파 조영제(즉, 가스가 채워진 마이크로버블)의 캐비테이션을 통한 세포내 분자 전달을 위한 초음파의 활용이다. 마이크로버블 캐비테이션은 주변 의 혈장 막(“sonoporation”)의 일시적인 천공을 유발할 수 있는 주변 매체에서 소류 효과를 유도하여 수동 또는 활성 운송메커니즘(10,11,12)을통해 생체 분자의 세포내 섭취를 급속히 허용한다. 초음파 증식은 세포에 대한 급속한 분자 전달을 위한 효과적인 기술이지만, 이러한 접근법은 종종 초음파 노출 조건에서 더 낮은 처리량과 높은 가변성에 의해 제한된 고가의 장비 및 대량 처리 방법이필요합니다(13) 이러한 한계를 해결하기 위해 현탁액에 있는 세포의 일관된 sonoporation를 가능하게 하는 acoustofluidic 장치는 현재 개발 중입니다.
Acoustofluidics는 다양한 응용 분야에 초음파 및 미세 유체 기술을 통합하는 확장 분야입니다. 이러한 접근법은 이전에 유체채널(14,15,16,17)내에서 서 있는 음향파를 유도하기 위해 연속 초음파 에너지를 적용하여 입자분리에사용되어 왔다. 입자는중간(16)에비해 입자 크기, 밀도 및 압축성 과 같은 다양한 특성에 따라 장치의 상이한 부분으로 정렬된다. 또한 Acoustofluidic 기술은 세포 치료제18의연구 응용 및 제조를 위한 다양한 세포 유형에 대한 신속한 분자 전달을 가능하게 하기 위해 개발 중이다. 최근에는 PDMS 기반 의 부동 유체장치(19)를사용하여 적혈구에 대한 향상된 분자 전달을 시연했다. 유동적인 플랫폼에서 세포 및 마이크로 버블 역학은 생체 분자의 향상된 전달을 가능하게 하는 물리적 상호 작용을 유도하기 위해 조작될 수 있습니다. 세포 내 분자 전달의 효율성과 일관성은 세포와 마이크로 버블 사이의 거리를 최적화하여 잠재적으로 증가 될 수 있습니다.
유동유체 중재 된 소공포화를위한 하나의 중요한 응용 프로그램은 1 차인간 T 세포로 생체 분자의 수송을 포함한다. 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T) 요법과 같은 입양 T 세포 전달에 기초한 면역요법은 HIV20과같은 암 및 바이러스를 포함한 다양한 질병의 치료를 위해 급속히 부상하고 있다. CAR T 요법은 소아 급성 림프구성 백혈병(ALL) 환자에서 특히 효과적이며, 70-90%21의완전한 완화율을 갖는다. 그러나, 이러한 치료법을 위한 T 세포 제조는 일반적으로 단백질 또는 소분자 와 같은 비유전적 생체분자를 전달하는 잠재적 인 삽입 돌연변이 발생, 긴 처리 시간 및 과제에 의해 제한된 바이러스 성전염에 의존한다. 수학적 유체 매개 분자 전달 방법은 잠재적으로 이러한 한계를 극복하고 T 세포 치료의 제조를 향상시킬 수 있습니다.
유동유체 매개 편광에 대한 또 다른 중요한 응용 프로그램은 동결 및 건조 시 세포를 보호하는 trehalose와 같은 방부제 화합물의 세포 내 전달을 포함합니다. Trehalose는 자연에서 일부 유기체에 의해 생성 되며 그들의 세포 막을 보호 하 여 동결 및 건조를 용납 하는 데 도움이22,23. 그러나, 트레할로오스는 포유류 세포에 의해 생성되지 않으며 포유류 세포막에 침투할 수 없다. 따라서, 세포화와 같은 효과적인 분자 전달 기술은 내부 세포 막을 보호하는 데 필요한 충분한 세포내 trehalose 수준을 달성하기 위해 필요합니다. 이 접근법은 현재 다양한 세포 유형의 건조 보존을 위해 개발 중입니다.
이 프로토콜은 마이크로 컨트롤러에 의해 구동 상대적으로 저렴한 비용 acoustofluidic 시스템의 조립 및 작동에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 초음파 조영제는 유체 채널 내의 초음파 포화를 유도하고 T 세포 및 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에 대한 신속한 분자 전달을 가능하게하는 데 활용됩니다. 이러한 아쿠스토유체 시스템은 다양한 연구 응용 분야에 사용될 수 있으며, 또한 세포 치료 제조 공정을 향상시키기 위한 소노포화 방법을 평가하는 프로토타입 시스템으로도 유용할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 연구 응용을 위한 생체 분자의 세포내 전달을 강화하는 저비용 acoustofluidic 시스템의 조립 그리고 작동을 설명합니다. 이 시스템을 조립하고 운영할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 요소가 있습니다. 이 부동 유체 장치는 일관된 채널치수(27)로쉽게 성형할 수 있는 생체 적합성 물질인 PDMS로 제조된다. 장치 채널은 배양 된 세포와 함께 작업 할 때 멸균을 높이기 위해…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 (#1827521, #1827521, #1450370)과 국립 보건 원 (U01HL127518)의 자금 으로 부분적으로 지원되었습니다. 포토리스그래피 서비스는 루이빌 마이크로/나노 기술 센터에서 제공되었습니다.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
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