कोशिकाओं को आणविक यौगिकों के उन्नत वितरण के लिए एक Acoustofluidic डिवाइस का असेंबली और संचालन
Summary
यह प्रोटोकॉल अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों द्वारा प्रेरित सोनोपोरेशन के माध्यम से कोशिकाओं को तेजी से आणविक वितरण के लिए कम लागत वाले एसीटोफ्लुइडिक डिवाइस की असेंबली और संचालन का वर्णन करता है।
Abstract
जैव अणुओं की कुशल इंट्रासेलुलर डिलीवरी जैव चिकित्सा अनुसंधान और सेल आधारित चिकित्सीय अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आवश्यक है। अल्ट्रासाउंड-मध्यस्थता सोनोपोरेशन बायोमॉलिक्यूल्स के तेजी से इंट्रासेलुलर डिलीवरी के लिए एक उभरती हुई तकनीक है। सोनोपोरेशन तब होता है जब गैस से भरे माइक्रोबबल्स का कैविटेशन पास के कोशिका झिल्ली में क्षणिक छिद्र बनाता है, जो आसपास के तरल पदार्थ से जैव अणुओं के तेजी से तेज करने में सक्षम बनाता है। निलंबन में कोशिकाओं के इन विट्रो सोनोपोरेशन के लिए वर्तमान तकनीक धीमी थ्रूपुट, प्रत्येक कोशिका के लिए अल्ट्रासाउंड जोखिम स्थितियों में परिवर्तनशीलता, और उच्च लागत से सीमित हैं। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, एक कम लागत वाला एसीटोफ्लुइडिक डिवाइस विकसित किया गया है जो पीडीएमएस-आधारित तरल उपकरण में अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को एकीकृत करता है ताकि कोशिकाओं के लगातार सोनोरेशन को प्रेरित किया जा सके क्योंकि वे अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों के संयोजन में चैनलों के माध्यम से प्रवाहित होते हैं। डिवाइस पीडीएमएस आधारित तरल चिप का उत्पादन करने के लिए मानक फोटोलिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके निर्मित है। एक अल्ट्रासाउंड पीजो डिस्क ट्रांसड्यूसर डिवाइस से जुड़ा होता है और माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित होता है। असेंबली को अतिरिक्त सुरक्षा के लिए 3 डी-मुद्रित मामले के अंदर एकीकृत किया जा सकता है। कोशिकाओं और माइक्रोबबल्स को सिरिंज पंप या पीवीसी ट्यूबिंग से जुड़े पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके डिवाइस के माध्यम से धक्का दिया जाता है। मानव टी कोशिकाओं और फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को जैव अणुओं की बढ़ी हुई डिलीवरी इस एसीटोफ्लुइडिक सिस्टम के साथ प्रदर्शित की जाती है। थोक उपचार दृष्टिकोणों की तुलना में, यह एसी्टोफ्लुइडिक सिस्टम थ्रूपुट बढ़ाता है और परिवर्तनशीलता को कम करता है, जो जैव चिकित्सा अनुसंधान अनुप्रयोगों और सेल आधारित चिकित्सीय के विनिर्माण के लिए सेल प्रसंस्करण विधियों में सुधार कर सकता है।
Introduction
कोशिकाओं को आणविक वितरण को बढ़ाने के लिए वायरल और गैर-वायरल प्लेटफार्मों का उपयोग किया गया है। वायरल डिलीवरी (ट्रांसडक्शन) एक आम तकनीक है जो कोशिका-आधारित उपचारों में उपयोग की जाती है जिसमें जीनोमिक संशोधन की आवश्यकता होती है। वायरल डिलीवरी के साथ सीमाओं में संभावित सम्मिलनीय म्यूटेनेसिस, सीमित ट्रांसजेनिक क्षमता, और संक्रमण की अवांछित बहुलता1,2शामिल हैं। इसलिए, गैर वायरल आणविक वितरण तकनीक जैव चिकित्सा और अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विकास में हैं। सामान्य तकनीकों में यांत्रिक, विद्युत, हाइड्रोडायनामिक, या कोशिकाओं में जैव अणुओं के तेज को बढ़ाने के लिए लेजर-आधारित ऊर्जा का उपयोग शामिल है 3। इलेक्ट्रोपॉलपेशन एक आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला गैर- वायरल आणविक वितरण मंच है जिसमें आणविक यौगिकों 4 ,5 ,6,7,8,9केइंट्रासेलुलर डिलीवरी के लिए प्लाज्मा झिल्ली में क्षणिक छिद्र को प्रेरित करने की क्षमता है। हालांकि, प्लाज्मा झिल्ली का क्षणिक छिद्र एक स्टोचस्टिक प्रक्रिया है और इलेक्ट्रोपॉशन के माध्यम से आणविक तेज आम तौर पर क्षणिक झिल्ली छिद्रों में निष्क्रिय प्रसार पर निर्भर करता है4,7,8.
एक वैकल्पिक विधि अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों (यानी गैस से भरे माइक्रोबबल्स) के कैविटेशन के माध्यम से बढ़ी हुई इंट्रासेलुलर आणविक वितरण के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग है। माइक्रोबबल कैविटेशन आसपास के मीडिया में माइक्रोस्ट्रीमिंग प्रभाव पैदा करता है जो पास के प्लाज्मा झिल्ली (“सोनोपोरेशन”) के क्षणिक छिद्र का कारण बन सकता है, जिससेनिष्क्रिय या सक्रिय परिवहन तंत्र10, 11,12के माध्यम से जैव अणुओं के तेजी से अंतरकोशिकीय तेज होने की अनुमति मिल सकती है। सोनोपोरेशन कोशिकाओं को तेजी से आणविक वितरण के लिए एक प्रभावी तकनीक है, लेकिन इस दृष्टिकोण में अक्सर महंगे उपकरण और थोक उपचार विधियों की आवश्यकता होती है जो कम थ्रूपुट और अल्ट्रासाउंड एक्सपोजर स्थितियों में उच्च परिवर्तनशीलता से सीमित हैं13। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, एसीओस्टोफ्लुइडिक उपकरण, जो निलंबन में कोशिकाओं के लगातार सोनोपोरेशन को सक्षम करते हैं, वर्तमान में विकास में हैं।
Acoustofluidics एक विस्तार क्षेत्र है जो विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए अल्ट्रासाउंड और माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों को एकीकृत करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग पहले कण पृथक्करण के लिए किया जाता रहा है ताकितरलचैनलों 14 , 15, 16,17के भीतर खड़ी ध्वनिक तरंगों को प्रेरित करने के लिए निरंतर अल्ट्रासाउंड ऊर्जा लागू की जा सके । कणों को विभिन्न गुणों जैसे कणों के आकार, घनत्व और मध्यम16के सापेक्ष संपीड़न के आधार पर डिवाइस के विभिन्न हिस्सों की ओर क्रमबद्ध किया जाता है। 18अनुसंधान अनुप्रयोगों और सेल चिकित्सा के निर्माण के लिए विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में तेजी से आणविक वितरण को सक्षम करने के लिए एसीटोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों का भी विकास हो रहा है । हाल ही में, हमने पीडीएमएस-आधारित एसीस्टोफ्लुइडिक डिवाइस19का उपयोग करके एरिथ्रोसाइट्स को बढ़ी हुई आणविक वितरण का प्रदर्शन किया। एसीओस्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में, सेल और माइक्रोबबल गतिशीलता को शारीरिक बातचीत के लिए प्रेरित करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है जो बायोमॉलिक्यूल्स के उन्नत वितरण को सक्षम करता है। कोशिकाओं और माइक्रोबबल्स के बीच की दूरी को अनुकूलित करके इंट्रासेलुलर आणविक वितरण की दक्षता और स्थिरता को संभावित रूप से बढ़ाया जा सकता है।
एसीटोफ्लुइडिक-मध्यस्थता सोनोपोरेशन के लिए एक महत्वपूर्ण आवेदन में प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में जैव अणुओं का परिवहन शामिल है। दत्तक टी सेल हस्तांतरण पर आधारित इम्यूनोथेरपी, जैसे चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल (कार टी) थेरेपी, कैंसर और एचआईवी20जैसे वायरस सहित विभिन्न बीमारियों के उपचार के लिए तेजी से उभर रहे हैं । कार टी थेरेपी बाल चिकित्सा तीव्र लिंफोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (सभी) रोगियों में विशेष रूप से प्रभावी रहा है, 70-90%21की पूरी छूट दर के साथ । हालांकि, इन उपचारों के लिए टी सेल विनिर्माण आम तौर पर वायरल ट्रांसडक्शन पर निर्भर करता है जो संभावित सम्मिलनीय म्यूटेनेसिस, लंबे प्रसंस्करण समय और प्रोटीन या छोटे अणुओं जैसे गैर-आनुवंशिक जैव अणुओं को वितरित करने की चुनौतियों से सीमित है1। Acoustofluidic-मध्यस्थता आणविक वितरण विधियों संभावित इन सीमाओं को दूर करने और टी सेल चिकित्सा के निर्माण में सुधार कर सकते हैं ।
एसी्टोस्टिविक-मध्यस्थता सोनोपोरेशन के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण आवेदन में परिरक्षक यौगिकों की इंट्रासेलर डिलीवरी शामिल है, जैसे ट्रेहालोस, जो ठंड और डिसिकेशन के दौरान कोशिकाओं की रक्षा करते हैं। ट्रेहलोज प्रकृति के कुछ जीवों द्वारा उत्पन्न होता है और वे अपनी सेलुलर झिल्ली की रक्षा करके ठंड और आनंद को सहन करने में मदद करता है22,23. हालांकि, ट्रेहलोस स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित नहीं होता है और स्तनधारी कोशिका झिल्ली के लिए अभेद्य है। इसलिए, आंतरिक सेलुलर झिल्ली की रक्षा के लिए आवश्यक पर्याप्त इंट्रासेलुलर ट्रेहलोस स्तर प्राप्त करने के लिए सोनोपोरेशन जैसी प्रभावी आणविक वितरण तकनीकें आवश्यक हैं। यह दृष्टिकोण वर्तमान में विभिन्न सेल प्रकारों के शुष्क संरक्षण के लिए विकास में है।
यह प्रोटोकॉल एक माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित अपेक्षाकृत कम लागत वाली एसीओटोफ्लुइडिक प्रणाली के असेंबली और संचालन का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का उपयोग तरल चैनलों के भीतर सोनोपोरेशन को प्रेरित करने और टी कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल प्रकारों में तेजी से आणविक वितरण को सक्षम करने के लिए किया जाता है। इस एसीटोफ्लुइडिक सिस्टम का उपयोग विभिन्न प्रकार के शोध अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है और बेहतर सेल थेरेपी विनिर्माण प्रक्रियाओं के लिए सोनोपोरेशन विधियों का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटोटाइप प्रणाली के रूप में भी उपयोगी हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एक कम लागत वाली एसीकोफ्लुइडिक प्रणाली के असेंबली और संचालन का वर्णन करता है जो अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए जैव अणुओं के इंट्रासेलुलर डिलीवरी को बढ़ाता है। इस प्रणाली को कोडांतरण और संचा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (#1827521, #1827521, #1450370) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (U01HL127518) से फंडिंग करके भाग में समर्थन दिया गया था । यूनिवर्सिटी ऑफ लुइसविले माइक्रो/नैनो टेक्नोलॉजी सेंटर द्वारा फोटोलिथोग्राफी सेवाएं प्रदान की गईं ।
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
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