Montering och drift av en acoustofluidic enhet för förbättrad leverans av molekylära föreningar till celler
Summary
Detta protokoll beskriver montering och drift av en billig acoustofluidic enhet för snabb molekylär leverans till celler via sonoporation framkallas av ultraljud kontrastmedel.
Abstract
Effektiv intracellulär leverans av biomolekyler krävs för ett brett spektrum av biomedicinsk forskning och cellbaserade terapeutiska tillämpningar. Ultraljud-medierad sonoporation är en framväxande teknik för snabb intracellulär leverans av biomolekyler. Sonoporation sker när kavitation av gasfyllda mikrobubblor bildar övergående porer i närliggande cellmembran, vilket möjliggör snabb användning av biomolekyler från den omgivande vätskan. Nuvarande tekniker för in vitro-sonoporering av celler i suspension begränsas av långsam genomströmning, variabilitet i ultraljudsexponeringsförhållandena för varje cell och höga kostnader. För att hantera dessa begränsningar har en billig akoustofluidic enhet utvecklats som integrerar en ultraljud givare i en PDMS-baserad fluidic enhet för att inducera konsekvent sonoporation av celler när de strömmar genom kanalerna i kombination med ultraljud kontrastmedel. Enheten tillverkas med hjälp av standardfotolitografitekniker för att producera det PDMS-baserade fluidiska chipet. En ultraljud piezo disk givare är ansluten till enheten och drivs av en mikrokontroller. Monteringen kan integreras i ett 3D-printat fodral för extra skydd. Celler och mikrobubblor trycks genom enheten med hjälp av en sprutpump eller en peristaltisk pump ansluten till PVC-slangar. Förbättrad leverans av biomolekyler till mänskliga T-celler och lungcancerceller demonstreras med detta akoustofluidic system. Jämfört med bulkbehandlingsmetoder ökar detta akoustofluidiska system genomströmningen och minskar variationen, vilket kan förbättra cellbearbetningsmetoderna för biomedicinska forskningstillämpningar och tillverkning av cellbaserade terapier.
Introduction
Virala och icke-virala plattformar har använts för att förbättra molekylär leverans till celler. Viral leverans (transduktion) är en vanlig teknik som används i cellbaserade terapier som kräver genomisk modifiering. Begränsningar med viral leverans inkluderar potentiell insertional mutagenes, begränsad transgen kapacitet och oönskade multiplicity av infektion1,2. Därför är icke-virala molekylära leveranstekniker under utveckling för ett brett spektrum av biomedicinska och forskningsapplikationer. Vanliga tekniker inkluderar mekanisk, elektrisk, hydrodynamisk eller användning av laserbaserad energi för att förbättra användningen av biomolekyler i celler 3. Elektroporering är en vanlig icke-viral molekylär leveransplattform som har förmågan att inducera övergående perforering i plasmamembranet för intracellulär leverans avmolekylära föreningar 4,5,6,7,8,9. Den övergående perforeringen av plasmamembranet är dock en stokastisk process och molekylär upptag via elektroporering är i allmänhet beroende av passiv diffusion över de övergående membranporerna4,7,8.
En alternativ metod är användning av ultraljud för förbättrad intracellulär molekylär leverans via kavitation av ultraljud kontrastmedel (dvs gasfyllda mikrobubblor). Mikrobubble cavitation inducerar mikroströmseffekter i det omgivande mediet som kan orsaka övergående perforering av närliggande plasmamembran (“sonoporation”) vilket möjliggör snabb intracellulär användning av biomolekyler via passiva eller aktivatransportmekanismer 10,11,12. Sonoporation är en effektiv teknik för snabb molekylär leverans till celler, men detta tillvägagångssätt kräver ofta dyr utrustning och bulkbehandlingsmetoder som begränsas av lägre genomströmning och högre variation i ultraljudsexponeringsförhållanden13. För att hantera dessa begränsningar är acoustofluidic enheter, som möjliggör konsekvent sonoporation av celler i suspension, för närvarande under utveckling.
Acoustofluidics är ett expanderande område som integrerar ultraljud och mikrofluidisk teknik för en mängd olika applikationer. Detta tillvägagångssätt har tidigare använts för partikelseparation genom att applicera kontinuerlig ultraljudsenergi för att inducera stående akustiska vågor inom de fluidiskakanalerna 14,15,16,17. Partiklar sorteras mot olika delar av enheten baserat på en mängd olika egenskaper som partikelstorlek, densitet och kompressibility i förhållande tillmediet 16. Acoustofluidic teknik är också under utveckling för att möjliggöra snabb molekylär leverans till en mängd olika celltyper för forskningsapplikationer och tillverkning av cellterapier18. Nyligen visade vi förbättrad molekylär leverans till erytrocyter med hjälp av en PDMS-baserad acoustofluidic enhet19. I den akoustofluidiska plattformen kan cell- och mikrobubbledynamik manipuleras för att inducera fysiska interaktioner som möjliggör förbättrad leverans av biomolekyler. Effektiviteten och konsekvensen hos intracellulär molekylär leverans kan potentiellt ökas genom att optimera avståndet mellan celler och mikrobubblor.
En viktig applikation för acoustofluidic-medierad sonoporation innebär transport av biomolekyler till primära mänskliga T-celler. Immunterapier baserade på adoptiv T-cellöverföring, såsom chimerisk antigenreceptor T-cell (CAR T) terapi, växer snabbt fram för behandling av olika sjukdomar, inklusive cancer och virus som HIV20. CAR T terapi har varit särskilt effektiv i pediatrisk akut lymfatisk leukemi (ALLA) patienter, med fullständig eftergift priser på 70-90%21. T-cellstillverkning för dessa terapier beror dock i allmänhet på virustransduktion som begränsas av potentiell infognings mutagenes, långa bearbetningstider och utmaningar med att leverera icke-genetiska biomolekyler som proteiner eller små molekyler1. Acoustofluidic-medierade molekylära leveransmetoder kan potentiellt övervinna dessa begränsningar och förbättra tillverkningen av T-cellsterapier.
En annan viktig applikation för acoustofluidic-medierad sonoporation innebär intracellulär leverans av konserveringsmedel föreningar, såsom trehalose, som skyddar celler under frysning och uttorkning. Trehalose produceras av vissa organismer i naturen och hjälper dem att tolerera frysning och uttorkning genom att skydda sina cellmembran22,23. Trehalos produceras dock inte av däggdjursceller och är ogenomtränglig för däggdjurscellmembran. Därför är effektiva molekylära leveranstekniker, såsom sonoporation, nödvändiga för att uppnå tillräckliga intracellulära trehalosnivåer som krävs för att skydda interna cellulära membran. Detta tillvägagångssätt är för närvarande under utveckling för torr bevarande av olika celltyper.
Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av montering och drift av ett relativt billigt acoustofluidic system drivs av en mikrokontroller. Ultraljud kontrastmedel används för att inducera sonoporation inom de fluidiska kanalerna och möjliggöra snabb molekylär leverans till olika celltyper, inklusive T-celler och cancerceller. Detta akoustofluidic system kan användas för en mängd olika forskningsapplikationer och kan också vara användbart som ett prototypsystem för att utvärdera sonoporationsmetoder för förbättrade cellterapi tillverkningsprocesser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver montering och drift av ett lågkostnads acoustofluidic system som förbättrar intracellulär leverans av biomolekyler för forskningsapplikationer. Det finns flera viktiga faktorer att tänka på när du monterar och använder det här systemet. Den acoustofluidic enheten är tillverkad i PDMS, som är ett biokompatierbart material som enkelt kan gjutas med konsekventakanaldimensioner 27. Enhetens kanaler kan sköljas med 15 ml 70% etanollösning före acoustofluidisk be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av finansiering från National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) och National Institutes of Health (U01HL127518). Fotolitografitjänster tillhandahölls av University of Louisville Micro/Nano Technology Center.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
