Summary

Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique

Published: June 16, 2021
doi:

Summary

Ce protocole décrit une analyse de journaliste pour étudier le règlement de la traduction d’ADN messagère dans les ovocytes simples pendant la maturation in vitro.

Abstract

Des événements liés à la maturation nucléaire d’oocyte ont été bien décrits. Cependant, on en sait beaucoup moins sur les voies moléculaires et les processus qui ont lieu dans le cytoplasme en préparation de la fécondation et de l’acquisition de la totipotence. Au cours de la maturation des ovocytes, les changements dans l’expression des gènes dépendent exclusivement de la traduction et de la dégradation des ARN messagers maternels (ARNm) plutôt que de la transcription. L’exécution du programme translationnel joue donc un rôle clé dans l’établissement de la compétence développementale des ovocytes pour soutenir le développement de l’embryon. Cet article fait partie d’un accent sur la définition du programme de traduction maternelle de l’ARNm qui a lieu pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote. Dans cet article de méthode, une stratégie est présentée pour étudier la régulation de la traduction des ARNm cibles au cours de la maturation in vitro des ovocytes. Ici, un rapporteur Ypet est fusionné à la région non traduite 3′ (UTR) du gène d’intérêt, puis micro-injecté dans les ovocytes avec l’ARNm polyadénylé codant pour mCherry pour contrôler le volume injecté. En utilisant la microscopie time-lapse pour mesurer l’accumulation de rapporteur, les taux de traduction sont calculés à différentes transitions au cours de la maturation méiotique des ovocytes. Ici, les protocoles pour l’isolement et l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits, utilisant le Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ UTR reporter comme exemple.

Introduction

Un ovocyte de mammifère adulte subit des changements rapides dans la préparation à la fécondation et à l’acquisition de la totipotence. Ces changements sont essentiels pour soutenir le développement embryonnaire après la fécondation. Bien que les événements associés à la maturation nucléaire soient relativement bien décrits, on en sait beaucoup moins sur les processus moléculaires et les voies dans le cytoplasme des ovocytes. Au cours des dernières étapes de la maturation des ovocytes, les ovocytes sont transcriptionnellement silencieux, et l’expression des gènes dépend entièrement de la traduction et de la dégradation de l’ARNm1,2. La synthèse des protéines critiques pour la compétence développementale s’appuie donc sur un programme de traduction chronométré d’ARNm à longue durée de vie qui ont été synthétisés plus tôt au cours de la croissancedes ovocytes 1,3. Dans le cadre d’un accent sur la définition de ce programme de traduction maternelle de l’ARNm exécuté pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote, cet article présente une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction des ARNm maternels cibles dans des ovocytes simples au cours de la maturation méiotique in vitro.

Dans cette méthode, le cadre de lecture ouvert YPet est cloné en amont de l’UTR 3′ de la transcription d’intérêt. Ensuite, les ARNm codant pour ce rapporteur sont micro-injectés dans les ovocytes avec des ARNm polyadenylé codant pour contrôler le volume injecté. L’accumulation de reporter est mesurée pendant la maturation méiotique in vitro d’ovocyte utilisant la microscopie de time-lapse. L’accumulation de protéines fluorescentes jaunes (YFP) et de mCherry est enregistrée dans les ovocytes individuels, et les signaux YFP sont corrigés par le niveau stabilisé du mCherry co-injecté. Après l’acquisition des données, les taux de translation sont calculés pour différents intervalles de temps au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro en calculant la pente de la courbe obtenue par ajustement de courbe.

Cette approche fournit un outil pour confirmer expérimentalement les changements dans la traduction des ARNm endogènes sélectionnés. De plus, cette méthode facilite la caractérisation des éléments régulateurs qui contrôlent la traduction lors de la maturation méiotique des ovocytes en manipulant les éléments cis-régulateurs du 3′ UTR des ARNm cibles4,5,6. La manipulation de la longueur de la queue poly(A) permet également de mieux comprendre l’activité de l’adénylase/deadenylase dans les ovocytes5. La mutagenèse d’éléments cis-agissants ou d’immunoprécipitation de l’ARN peut être utilisée pour étudier les interactions avec les protéines de liaison à l’ARN apparenté6,7. De plus, cette méthode peut être utilisée pour identifier les composants essentiels du programme de traduction qui sont essentiels pour la compétence développementale des ovocytes en mesurant la traduction de l’UTR cible 3′ dans des modèles associés à une diminution de la qualité des ovocytes 8,9,10. Ce document de méthode présente une expérience représentative où des ovocytes dénudés de souris C57/BL6 âgées de 21 jours ont été micro-injectés avec un journaliste de Ypet fusionné au 3′ UTR d’IL-7. L’installation et le protocole pour l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits.

Protocol

Les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Californie à San Francisco (protocole AN182026). 1. Préparation des médias Ajouter tous les composants, comme décrit dans le tableau 1, pour faire le milieu de collecte des ovocytes de base et le milieu de maturation des ovocytes. Pour le support de collecte de base, réglez le pH sur 7,4. Pour le milieu de collect…

Representative Results

Des ovocytes I-arrêtés de prophase dénudés des souris C57/BL6 de 21 jours ont été injectés avec un mélange de journaliste contenant l’ADN messagère codant le journaliste de Ypet fusionné au 3′ UTR d’IL-7 et adn messagère codant mCherry. L’expression de YFP et de mCherry a été enregistrée dans 39 oocytes, dont 30 ont été mûris, et 9 ont été arrêtés dans la prophase I comme commande négative. Trois ovocytes en maturation ont été exclus pour l’analyse parce qu’ils avaient un GVBD retardé (…

Discussion

La méthode présentée décrit une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction de l’ARNm cible à différentes transitions au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro. IL-7, une cytokine libérée par l’ovocyte qui peut être impliquée dans la communication cellulaire ovocyte-cumulus 8,13, a été choisie dans le but de décrire ce procédé. IL-7 est connu pour être de plus en plus traduit pendant la ma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM097165, GM116926 et Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 à Marco Conti. Enrico M. Daldello a été soutenu par une bourse de la Fondation Lalor et Natasja G. J. Costermans a été soutenu par une bourse Rubicon de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO).

Materials

Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra Sigma-Aldrich SIAL-A3311
Cilostamide EMD Millipore 231085
MEM alpha Gibco 12561-056
Minimum Essential Medium Eagle  Sigma-Aldrich M2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered Genesee Scientific Corporation (GenClone) 25-512
Sodium Bicarbonate  JT-Baker 3506-1
Sodium Pyruvate Gibco  11360-070
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
Agarose Apex Biomedical  20-102QD
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C1389-1G
Choo-Choo Cloning Kit McLab CCK-20
CutSmart Buffer (10x) New England Biolabs B7204
DNA loading dye (6x) Thermo Scientific R0611
dNTP Solution New England Biolabs N0447S
DpnI New England Biolabs R0176
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Fisher SM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova  Teknova L1010
LB Medium (Capsules) MP Biomedicals 3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Life Technologies AM1908
MfeI-HF restriction enzyme New England Biolabs R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit Invitrogen AM1344
Phusion High Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530
Poly(A) Tailing kit Invitrogen AM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit  Qiagen 27106
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
S.O.C. medium Thermo Fisher 15544034
TAE buffer  Apex Biomedical  20-193
Ultrapure Ethidium Bromide Solution Life Technologies 15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA
Calibrated micro-pipettes Drummond Scientific Company 2-000-025 
PMSG- 5000 Mybiosource MBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 BD 305111
Syringe 1 ml BD 309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated MatTek P35G-0-20-C For time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filament Sutter Instrument BF100-78-10
Oil for Embryo Culture Irvine Scientific 9305
Petri Dish Falcon 351006 For micro-injection
Tissue Culture Dish Falcon 353001 For oocyte incubation
VacuTip Holding Capillary Eppendorf 5195000036
Software
Biorender BioRender Preparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0  Molecular Devices  For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

References

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Costermans, N. G. J., Daldello, E. M., Marathe, R. J., Conti, M. Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay. J. Vis. Exp. (172), e62041, doi:10.3791/62041 (2021).

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