Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un solo ensayo de reportero de ovocitos
Summary
Este protocolo describe un análisis del reportero para estudiar la regulación de la traducción del mRNA en solos ovocitos durante la maduración in vitro.
Abstract
Los eventos asociados con la maduración nuclear de ovocitos han sido bien descritos. Sin embargo, se sabe mucho menos acerca de las vías moleculares y procesos que tienen lugar en el citoplasma en preparación para la fertilización y adquisición de totipotency. Durante la maduración de los ovocitos, los cambios en la expresión génica dependen exclusivamente de la traducción y degradación de los ARN mensajeros maternos (ARNm) en lugar de la transcripción. La ejecución del programa traslacional, por lo tanto, juega un papel clave en el establecimiento de la competencia de desarrollo de ovocitos para sostener el desarrollo embrionario. Este papel es parte de un foco en la definición del programa de la traducción maternal del mRNA que ocurre durante la maduración meiótica y en la transición del oocyte-a-cigoto. En este trabajo de método, se presenta una estrategia para estudiar la regulación de la traducción de arns diana durante la maduración in vitro de los ovocitos. Aquí, un reportero de Ypet se fusiona a la región sin traducir 3′ (UTR) del gen de interés y luego se microinyecta en ovocitos junto con la codificación de ARNm poliadenilada para que mCherry controle el volumen inyectado. Mediante el uso de microscopía de lapso de tiempo para medir la acumulación de reporteros, las tasas de traducción se calculan en diferentes transiciones durante la maduración meiótica de los ovocitos. Aquí, los protocolos para el aislamiento y la inyección del oocyte, la grabación del lapso de tiempo, y el análisis de datos se han descrito, usando el Ypet/interleukin-7 (IL-7) – 3′ UTR reportero como ejemplo.
Introduction
Un ovocito mamífero completamente crecido sufre cambios rápidos en la preparación para la fertilización y la adquisición de totipotency. Estos cambios son esenciales para sostener el desarrollo embrionario después de la fertilización. Aunque los eventos asociados con la maduración nuclear están relativamente bien descritos, se sabe mucho menos sobre los procesos moleculares y las vías en el citoplasma de los ovocitos. Durante las etapas finales de la maduración de los ovocitos, los ovocitos son transcripcionalmente silenciosos, y la expresión génica depende totalmente de la traducción y degradación delARNm 1,2. La síntesis de proteínas críticas para la competencia en el desarrollo, por lo tanto, se basa en un programa de traducción cronometiva de ARNm de larga vida que se han sintetizado antes durante el crecimientode los ovocitos 1,3. Como parte de un foco en la definición de este programa de la traducción maternal del mRNA ejecutada durante la maduración meiótica y en la transición del oocyte-a-cigoto, este papel presenta una estrategia para estudiar la activación y la represión de la traducción de los mRNAs maternales de la blanco en solos ovocitos durante la maduración meiotic in vitro.
En este método, el marco de lectura abierto YPet se clona aguas arriba de la 3′ UTR de la transcripción de interés. A continuación, los ARNm que codifican este reportero se microinyectan en los ovocitos junto con los ARNm poliadenilados que codifican mCherry para controlar el volumen inyectado. La acumulación del reportero se mide durante la maduración meiótica in vitro del oocyte usando microscopia del lapso de tiempo. La acumulación de proteína fluorescente amarilla (YFP) y mCherry se registra en ovocitos individuales, y las señales de YFP se corrigen por el nivel estancado de la mCherry co-inyectada. Después de la adquisición de datos, las tasas de traducción se calculan para diferentes intervalos de tiempo durante la maduración meiótica de ovocitos in vitro calculando la pendiente de la curva obtenida por el ajuste de la curva.
Este enfoque proporciona una herramienta para confirmar experimentalmente los cambios en la traducción de ARNm endógenos seleccionados. Además, este método facilita la caracterización de los elementos reguladores que controlan la traslación durante la maduración meiótica de los ovocitos mediante la manipulación de elementos cis-reguladores de la UTR 3′ de los ARNm diana4,5,6. La manipulación de la longitud de la cola de poli(A) también permite comprender la actividad de la adenilasa/deadenilasa enlos ovocitos 5. La mutagénesis de elementos de acción cis o inmunoprecipitación de ARN puede utilizarse para estudiar las interacciones con proteínas de unión a ARN cognado6,7. Además, este método se puede utilizar para identificar los componentes esenciales del programa de traducción que son críticos para la competencia en el desarrollo de los ovocitos mediante la medición de la traducción de utr objetivo 3′ en modelos asociados con la disminución de la calidad de los ovocitos 8,9,10. Este papel del método presenta un experimento representativo donde los ovocitos denudados de 21 días de ratones C57/BL6 se han micro-inyectado con un reportero de Ypet fundido al 3′ UTR de IL-7. La configuración y el protocolo para la inyección del oocyte, la grabación del lapso de tiempo, y el análisis de datos se han descrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
El actual método describe una estrategia para estudiar la activación y la represión de la traducción del mRNA de la blanco en diversas transiciones durante la maduración meiótica in vitro del oocyte. IL-7, un cytokine lanzado por el oocyte que se puede implicar en la comunicación8de la célula del oocyte-cumulus,13,fue elegido con el fin de describir este método. Il-7 se sabe para ser traducido cada vez más durante la maduración<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH R01 GM097165, GM116926 y Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 a Marco Conti. Enrico M. Daldello recibió el apoyo de una beca de la Fundación Lalor y Natasja G. J. Costermans recibió el apoyo de una beca Rubicon de la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
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