Summary
이 프로토콜은 시험관 내 성숙 시 단일 난초에서 mRNA 번역의 조절을 연구하기 위해 기자 분석에 설명합니다.
Abstract
난수 핵 성숙과 관련된 사건은 잘 설명되어 있다. 그러나, 훨씬 적은 풍부하게 함의 풍부하게 하고 취득을 위한 준비에 있는 세포질에서 일어나는 분자 통로 및 프로세스에 관하여 알려져 있습니다. 난모성 성숙 도중, 유전자 발현의 변경은 전사보다는 모계 메신저 RNA (mRNA)의 번역 그리고 저하에 전적으로 달려 있습니다. 따라서 번역 프로그램의 실행은 배아 발달을 유지하기 위해 난소 세포 발달 역량을 확립하는 데 중요한 역할을합니다. 이 논문은 메이오틱 성숙 과 난소 - zygote 전환 에서 발생하는 모계 mRNA 번역의 프로그램을 정의하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 논문에서는 체외 내분피 성숙 중에 표적 mRNA의 번역 을 연구하는 전략이 제시됩니다. 여기서, Ypet 기자는 관심 있는 유전자의 3'un번역 영역(UTR)에 융합된 다음, 주입된 부피를 제어하기 위해 mCherry를 위한 폴리아데니얼mRNA 인코딩과 함께 난모세포에 마이크로 주입된다. 시간 경과 현미경 을 사용하여 기자 축적을 측정함으로써, 번역 속도는 난소 메이오틱 성숙 동안 다른 전환에서 계산됩니다. 여기서, 난소 분리 및 주입, 시간 경과 기록 및 데이터 분석을 위한 프로토콜이 Ypet/interleukin-7(IL-7)-3'UTR 리포터를 예로 들 수 있다.
Introduction
완전히 자란 포유류 난소세포는 토티포텐시의 수정 및 획득에 대비하여 급격한 변화를 겪습니다. 이러한 변화는 수정 후 배아 발달을 유지하는 데 필수적입니다. 핵 성숙과 관련된 사건은 비교적 잘 설명되어 있지만, 난모세포 세포질의 분자 과정과 경로에 대해 훨씬 적게 알려져 있습니다. 난모세포 성숙의 마지막 단계 동안, 난모세포는 전사적으로 침묵하며 유전자 발현은 mRNA 번역 및 분해1,2에전적으로 의존한다. 발달 능력에 중요한 단백질의 합성은, 그러므로, oocyte 성장1,3도중 이전에 합성된 장수 mRNA의 시간별 번역의 프로그램에 의존합니다. 메이오능 성숙 과 난소 -zygote 전환 중에 실행 된 모성 mRNA 번역의이 프로그램을 정의하는 초점의 일환으로,이 논문은 체외 메이오틱 성숙 동안 단일 oocytes에서 대상 모계 mRNAs의 번역의 활성화 및 억압을 연구하는 전략을 제시한다.
이 방법에서 YPet 오픈 판독 프레임은 관심 있는 성적증명서의 3' UTR의 상류로 복제됩니다. 다음으로, mRNA는 주입된 볼륨을 제어하기 위해 mCherry를 코딩하는 폴리아데니얼mRNA와 함께 난모세포에 마이크로 주입된다. 리포터 축적은 시간 경과 현미경 검사를 사용하여 체외 수막 마이오틱 성숙 중에 측정됩니다. 황색 형광 단백질(YFP)과 mCherry의 축적은 개별 난소세포에 기록되며, YFP 신호는 공동 주입된 mCherry의 고원 수준에 의해 수정된다. 데이터 수집 후, 변환 속도는 곡선 피팅에 의해 얻어진 곡선의 경사를 계산하여 체외 우피 메이오틱 성숙 중에 다른 시간 간격으로 계산됩니다.
이 방법은 선택한 내생 성 mRNA의 번역 의 변화를 실험적으로 확인하는 도구를 제공합니다. 또한, 이 방법은 표적 mRNA4,5,6의3'UTR의 시스-규제 요소를 조작하여 난파성 메이오틱 성숙 시 번역을 제어하는 조절 요소의 특성화를 용이하게 한다. 폴리(A) 꼬리 길이를 조작하면 난모세포5에서아데닐라제/데아데닐라제 활동에 대한 통찰력을 허용한다. 시스 작용 원소 또는 RNA 면역 침전의 돌연변이 발생은 코그네이트 RNA 결합 단백질6,7과의상호 작용을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이 방법은 오낭화 화질 감소와 관련된 모델에서 타겟 3'UTR 번역을 측정하여 난낭성 개발 능력에 중요한 번역 프로그램의 필수 구성 요소를 식별하는 데 사용할 수 있다 8,9,10. 이 방법 논문은 IL-7의 3'UTR에 융합된 Ypet 리포터와 함께 21일 된 C57/BL6 마우스의 디누드 난동구가 마이크로 주입된 대표적인 실험을 제시한다. 난구 주입, 시간 경과 기록 및 데이터 분석을 위한 설정 및 프로토콜이 설명되었습니다.
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Protocol
동물과 관련된 실험 절차는 샌프란시스코 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 AN182026).
1. 미디어 준비
- 표 1에설명된 대로 모든 구성 요소를 추가하여 기본 난낭 수거 배지 및 난모세포 성숙 배지를 만듭니다. 기본 컬렉션 매체의 경우 pH를 7.4로 설정합니다. 수집 및 성숙 배지의 경우 사용 당일 소 세럼 알부민(BSA)과 1 μM 시로스타미드를 3mg/mL추가합니다.
2. Ypet-3'UTR 및 mCherry용 mRNA 인코딩 준비
- 관심있는 mRNA의 3′ UTR 시퀀스를 가져옵니다.
참고: 이 연구를 위해, 서열은 이전에 마우스 oocyte cDNA에서 얻어졌습니다. - Ypet 코딩 서열, V5-에피토프 태그 및 T7 프로모터를 포함하는 pcDNA 3.1 벡터의 오키테 cDNA 및 부분으로부터 표적 3'UTR을 증폭시키는 설계 프라이머.
- 고충실도 DNA 폴리머라제 키트를 사용하여 증폭. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 제품을 젤상에 실행하여 조각이 정확한 크기인지 확인하고, 밴드를 잘라내고, 제조업체의 지시에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 젤에서 DNA를 추출한다.
- PCR 복제 키트를 사용하여 PCR 조각을 벡터에 융합합니다.
참고: PCR 파편은 보다 효율적인 재조합 과정을 용이하게 하기 위해 4시간 동안 얼음에 배양되었습니다. 이것은 단지 45 분의 잠복 시간을 권장하는 제조업체의 지침과 는 상반됩니다. - 트랜스펙트 PCR은 유능한 5-α 대장균 균으로 단편화합니다.
- 박테리아에 믹스와 플라스미드를 넣고 얼음에 30분 동안 배양합니다.
- 혼합물과 플라스미드를 42°C에서 45초로 가열하고, 얼음에서 3분간 즉시 식힙니다.
- 카타볼라이트 억압(SOC) 배지로 슈퍼 최적 국물의 500μL을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 7000 × g에서 2분 동안 회전하고 대부분의 상체를 제거합니다. 적절한 선택 항생제로 Luria Broth (LB) 한마접시에 재중단 및 플레이트.
참고: 카베니실린은 이 연구에서 사용되었습니다. - 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 콜로니 중 하나에 파이펫 팁을 가볍게 누르고 카베니실린 100 μg/mL로 LB 배지 3mL에 배치하여 식민지를 분리합니다. 37°C에서 12-24h의 인큐베이션을 사용할 수 있습니다.
- 제조 업체의 지시에 따라 플라스미드 DNA 격리 키트를 사용하여 플라스미드의 DNA를 추출하고 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인합니다.
- For Ypet/3' UTR:
- 시험관 내 전사를 위한 선형 PCR 템플릿을 생성합니다. Ypet 서열의 전방 프라이머 상류와 20개의 추가 티민 잔류가 있는 역프라이머를 사용합니다. Ypet/IL-7 3' UTR 의 시퀀스와 전방 및 역 프라이머의 시퀀스에 대한 표 2를 참조하십시오.
참고: 이러한 추가 티민 잔류물은 시험관 내 전사 후 선형 mRNA에 올리고(A)를추가합니다. - 시험관 내는 제조업체의 지침에 따라 T7 전사 키트를 사용하여 PCR 제품을 전사합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 전사 정리 키트를 사용하여 결과 보완 RNA (cRNA)를 정화합니다.
- RNA가 없는 물에서 정제된 cRNA를 엘테우트하고, 농도를 측정하고, 아가로 전기전도에 의한 무결성을 평가합니다. -80 °C에서 저장합니다.
- 시험관 내 전사를 위한 선형 PCR 템플릿을 생성합니다. Ypet 서열의 전방 프라이머 상류와 20개의 추가 티민 잔류가 있는 역프라이머를 사용합니다. Ypet/IL-7 3' UTR 의 시퀀스와 전방 및 역 프라이머의 시퀀스에 대한 표 2를 참조하십시오.
- mCherry의 경우:
- 고충실도 제한 효소를 이용하여 체외 전사를 위한 선형 PCR 템플릿을 생성; 이 예제를 복제하는 경우 제한 효소 mfEI-HF를 사용한다. 37 °C에서 하룻밤 동안 소화 버퍼로 소화하십시오.
- 젤을 실행하여 샘플을 정화하고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 선형 DNA를 추출합니다.
- 시험관 내는 제조업체의 지침에 따라 T7 전사 키트를 사용하여 PCR 제품을 전사합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 폴리(A) 테일링 키트를 사용하여 cRNA(150-200 뉴클레오티드)를 폴리아데니레이트한다.
- 제조업체의 지침에 따라 전사 정리 키트를 사용하여 생성된 cRNA를 정화합니다.
- RNA가 없는 물에서 정제된 cRNA를 엘테우우고, mRNA 농도를 측정하고, 젤 전기전도에 의한 메시지 무결성을 평가한다. -80 °C에서 저장합니다.
3. 실험 절차
참고: 오키테 마이크로 주입 및 후속 시간 경과 현미경 검사법의 회로도 개요는 그림 1에서제공됩니다.
- 1일차
- 내회적으로 임신 한 마레의 혈청 생식선 호르몬의 5 IU와 21 일 된 마우스를 주입하여 개미 단계11에여포 성장을 촉진한다.
- 3일차
- 오사이클 컬렉션
- 난소를 수집하기 위해 프라이밍 후 마우스 44-48h를 희생하고 기본 난소 수집 매체와 플라스틱 페트리 접시에 배치합니다.
- 26 G 바늘로 여포 벽에 작은 상처를 만들어 조심스럽게 개미 여포를 엽니다. 입으로 작동하는 유리 파이펫을 사용하여 여러 층의 적분 세포로 그대로 적분동 된 난모세포 (COC)를 분리합니다.
- 더 작은 파이펫(오마사이클의 직경보다 약간 더 큰)을 사용하고 반복된 파이펫팅을 통해 COC를 기계적으로 디누드합니다.
참고: 또는 그대로 COC에 미세 주입을 수행합니다. - 더 큰 파이펫을 사용하여, 탈모세포를 흡습하고 성숙 배지를 가진 페트리 접시에 영양제 억제제, cilostamide의 1 μM로 보충하여 메이오틱성숙(12)의재개를 방지한다. 2 시간 동안 인큐베이터에 접시를 놓아 모낭에서 난모세포의 분리로 인한 스트레스로부터 난모세포가 회복될 수 있도록 한다.
- 오사이클 마이크로 주입
- 기계 풀러에 10cm 길이의 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 배치하여 주사 바늘을 준비합니다. 최적의 주입을 위해 가열된 필라멘트를 사용하여 바늘 끝을 45° 각도로 구부립니다.
- 기본 난낭수 수집 매체의 20 μL 액적으로 폴리스티렌 요리를 준비하고, 가벼운 미네랄 오일로 액적을 덮습니다.
- 12.5 μg/μL Ypet-3' UTR 및 12.5 μg/μL mCherry를 추가하여 기자 믹스를 준비합니다. 더 큰 볼륨을 준비하고 유사한 기자 농도를 보장하기 위해 향후 실험을 위해 알리쿼트를 만듭니다. 이 알리코를 -80°C에 저장합니다. 해동 시 먼저 알리쿼트에 20,000 x g로알리쿼트를 2분 간 분리하고 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮긴다.
참고: 이 원심 분리는 사출 바늘이 리포터 믹스의 잠재적 인 골재에 의해 막히는 것을 방지할 것입니다. - 기자 믹스의 약 0.5 μL로 모세혈관에 의한 주사 바늘을 적재한다.
- 홀더에 파이펫과 적재 된 주입 바늘을 놓고 난소 수집 매체의 액적에 배치합니다. 일부 배지를 홀딩 파이펫에 흡인합니다.
- 조심스럽게 보유 파이펫에 대해 눌러 주입 바늘을 엽니 다.
- 스테디트 컬렉션 매체의 액적에 난모를 놓고 리포터 믹스의 5-10 pL을 주입합니다.
- 16h의 1μM 시로사미드를 1μM 시로사미드로 성숙 배지에 배양하여 mCherry 신호를 고원에 허용합니다.
- 각 주입 된 기자에 대한 성숙 배지의 적어도 두 20 μL 방울과 시간 경과 현미경 검사에 사용되는 페트리 접시를 준비 : 제어 prophase I 체포 oocytes와 성숙 난모 세포에 대한 cilostamide없이 하나의 방울을 제어하기 위해 1 μM cilostamide와 하나의 방울. 물방울을 가벼운 미네랄 오일로 덮고 인큐베이터에 놓습니다.
- 시간 경과 현미경 검사법
- 배양 전 후 인큐베이터에서 주입된 난모세포를 제거하고 실로사미드없이 성숙 배지에서 4번 세척합니다. 1 μM 시로스타미드를 1단계로 성숙 배지에 일부 난토를 유지하여 i-체포된 난소세포 대조군으로 유지한다.
- 이전에 준비된 시간 경과 현미경 접시에 주입된 난모세포를 각각의 물방울로 옮깁니다. 닫힌 유리 파이펫을 사용하여 난모를 클러스터 (닫힌 파이펫은 몇 초 동안 화염에 끝을 잡고 준비 할 수있다).
참고: 난모세포를 클러스터링하면 녹음 중에 움직임을 방지할 수 있습니다. - 37°C 및 5%CO2에서유지되는 환경 챔버가 장착된 발광 다이오드 조명 시스템과 전동 스테이지를 갖춘 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 이 연구를 복제하려면 필터 세트: dichroic 미러 YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP 채널 (흥분 (Ex): S500/20 × 49057; 배출 (EM): D535/30 m 47281), mCherry 채널 (예: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- 시간 경과 실험에 적합한 설정을 입력합니다(이 스터디에 사용된 소프트웨어의 재료 표 참조): 앱 | 클릭 다중 차원 수집. 첫 번째 탭 메인을 선택하고 타임랩스, 여러 스테이지 위치및 여러 파장을 선택합니다.
- 탭 저장을 선택하여 실험을 저장해야 하는 위치를 입력합니다.
- 시간 경과 탭을 선택하여 시간 포인트, 기간 및 시간 간격을 입력합니다.
참고: 시간 경과 실험의 기간은 난피성 메이오성 성숙의 타이밍이 종 마다 다르기 때문에 연구된 동물 종에 달려 있습니다. 마우스 난모세포와 이 실험에서는 16시간 동안 15분마다 난모세포가 기록되었습니다. - 탭 스테이지를선택합니다. 밝은 필드에 전환하고 인수 | 선택하여 새 창을 열어 난모세포의 위치를 찾습니다. | 취득 라이브 표시. 난모세포가 있으면 다차원 획득 창으로 다시 전환하고 +를 눌러 난모세포의 위치를 설정합니다.
- 탭 파장을선택하고 브라이트필드(노출 15ms), YFP(Ypet/IL7 3' UTR용 노출 150ms), mCherry(Ypet/IL7 3' UTR의 노출 75ms)를 설정합니다.
참고: 기자 축적 수준과 주입된 볼륨에 따라 각 Ypet/3'UTR 리포터의 노출을 조정합니다. YFP 신호가 실험 시작 시 검출 범위의 중심에 속하여 번역활성화 시 과소 평가 또는 포화를 방지해야 합니다. mCherry의 경우, 신호가 폴리아데닐화 시술 중에 첨가된 아데닌 뉴클레오티드의 수에 따라 달라지므로 mCherry의 각 배치에 대한 노출을 조정한다. 폴리아데닐레이션 효율의 변화 때문에, 실험 간의 더 나은 비교를 위해 다른 실험에서 동일한 배치의 mCherry를 사용합니다. - 획득을클릭하여 시간 경과 실험을 시작합니다. 그림 2 및 보충 파일을 참조하여 단일 난소에서 시간 경과 기록의 예를 들어 보겠습니다.
- Ypet-3'UTR 번역 분석
- 이 분석의 경우(본 연구에서 사용되는 소프트웨어의 재료 표 참조)는 각 난소에 대해 두 개의 영역 측정을 수행합니다: 타원 영역을 클릭하고 난소세포에 가까운 오사이클과 작은 영역을 둘러싸고 직사각형 영역에서백그라운드 감산 클릭에 사용할 수 있습니다.
참고: 난모세포가 시간 경과 기록 중에 선택한 영역밖으로 이동하지 않도록 합니다. 극성 체압 주위의 영역 측정의 배치에 특별한주의를 기울이면, 이는 난소세포의 움직임을 유발하고 기록을 왜곡할 수 있기 때문이다. - 지역 측정 데이터를 먼저 로그를 클릭한 다음 로그 데이터를 클릭하여 스프레드시트로 내보내 데이터 분석 소프트웨어를 내보냅니다.
- 각 개별 난해체및 측정된 모든 시간점에 대해, 오키테 영역 측정에서 백그라운드 영역 측정을 뺍니다. YFP와 mCherry 파장에 대해 별도로 이 작업을 수행합니다.
- 발아 소포 고장(GVBD) 및 극성 체압(PBE)의 타이밍을 나중에 참조하여 기록합니다.
참고: GVBD가 2h를 초과할 때 성숙 마우스 난동을 제외합니다. - 각 난십에 대해 시간이 지남에 따라 YFP 및 mCherry 표현을 플롯하여 이상값을 확인합니다.
참고: 이 경우 녹음 중에 난모세포가 이동되었음을 나타낼 수 있는 부드러운 곡선이어야 합니다. - 각 개별 난마낭에 대해, 레코딩의 마지막 10시간 점에 대한 평균 mCherry 표현을 계산합니다. 각 시간점에 대해 YFP 식을 평균 mCherry 식으로 나누어 각 개별 난마낭에 대해 매 시간 지점에서 YFP/mCherry 비율을 얻기 위해 주입된 볼륨을 보정합니다.
- 선형 회귀에 의해 곡선의 경사를 피팅하여 특정 시간 간격에 대한 번역 속도를 계산합니다. 통계 추론을 사용하여 번역 률의 차이를 평가합니다.
- 이 분석의 경우(본 연구에서 사용되는 소프트웨어의 재료 표 참조)는 각 난소에 대해 두 개의 영역 측정을 수행합니다: 타원 영역을 클릭하고 난소세포에 가까운 오사이클과 작은 영역을 둘러싸고 직사각형 영역에서백그라운드 감산 클릭에 사용할 수 있습니다.
- 오사이클 컬렉션
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Representative Results
21일 된 C57/BL6 마우스의 탈누드 prophase I-체포 난동세포는 Il-7 및 mRNA 인코딩 mCherry의 3'UTR에 융합된 Ypet 기자를 코딩하는 mRNA를 포함하는 기자 믹스를 주입하였다. YFP와 mCherry 표현은 39개의 난초로 기록되었으며, 그 중 30개가 성숙되었고, 9명은 음의 통제로 1단계에서 체포되었다. 3개의 성숙한 난동체는 지연된 GVBD(N=2)를 가지고 있거나 기록(N=1) 동안 접시에 이동했기 때문에 분석을 위해 제외되었습니다. 도 3은 mCherry 및 YFP 발현을 prophase I 및 성숙 난모세포로 보여줍니다. 도 4는 주입된 볼륨에 대해 보정하기 위해 고원 mCherry 발현(마지막 10시간 지점에서 평균 mCherry 발현)에 대해 보정된 성숙 난초의 YFP 표현을 나타낸다. 리포터의 번역속도는 1단계 I에서 YFP/mCherry 값을 곡선 피팅(선형 회귀)으로 측정하고, 시로스타미드 방출 후 최초 0-2h 또는 8-10h 동안 난모세포가 성숙되는 것으로 측정하였다(그림5A). 리포터의 축적은 시로스타미드 방출 후 0-2h와 8-10h 사이의 번역률의 현저한 차이에 의해 표시된 선형 패턴을 따르지 않는다(p<0.0001; 그림 5B). 따라서 이러한 결과는 oocyte 메이오틱 성숙 시 IL-7 번역의 활성화를 나타낸다.
그림 1: 실험 절차의 회로도 개요. 올리고아데니얼드 Ypet/3' UTR 및 폴리아데니얼mRNA 인코딩 mCherry는 21일 된 C57/BL6 마우스의 난모세포에 마이크로 주입된다. 난초는 mCherry 신호가 고원에 도달 할 수 있도록 성숙 배지를 포함하는 cilostamide에서 16 h에 대한 사전 배양된다. 사전 배양 후, 난모세포가 cilostamide와 함께 매체로 보관되어 prophase I-체포 제어 그룹을 만들거나 성숙할 cilostamide 가 없는 매체로 방출되는 시간 경과 기록이 시작됩니다. 약어: UTR = 번역되지 않은 영역; YFP = 황형 단백질; fW 프라이머 = 앞으로 프라이머; 레브 프라이머 = 역 프라이머; 앰프 = 암피실린 저항; 폴리아 = 폴리아데닐; 올리고아 = 올리고아데닐; GV = 발아 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단일 난소 시간 경과 기록의 예. 브라이트필드, YFP, mCherry 레코딩 은 Ypet/Interleukin-7'UTR 및 polyadenylated mCherry를 prophase I, MI(시로스타미드 방출 후 6h) 및 MII(시로스타미드 출시 후 15h)로 인코딩하여 mRNAs를 주입한 단일 난소세포의 음반. 스케일 바 = 25 μm. 약어: YFP = 황형 단백질; GV = 발아 소포; MI = 메타페이오 I; MII = 메타페이오 II. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: YFP 및 mCherry 신호는 시간 경과 현미경 검사법에 의해 기록됩니다. YFP와 mCherry 신호 올리고아데니화 Ypet/IL7 3'UTR 및 폴리아데니화 mRNA 인코딩 mCherry와 함께 주입. 난초는 미상 I-체포 제어 군(N=9)을 생성하기 위해 시로스타미드를 사용하여 배지로 보관되거나 혼성(N=30)을 허용하기 위해 시트로스타미드 프리 배지로 방출되었다. 데이터는 개별 난해 측정입니다. 약어: IL-7 = 인터류빈-7; YFP = 황색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: YFP 신호가 공동 주입 된 mCherry 수준에 대해 수정되었습니다. YFP 신호는 YFP 신호를 마지막 10시간 지점의 평균 mCherry 신호로 나누어 주입된 부피에 대해 수정되었다. 개별 YFP/mCherry 비율(A)prophase I-체포 난모세포 및(B)성숙 난모세포 및 평균 YFP/mCherry 비율의 표준 오차 ±를 의미(C)prophase I-체포 및(D)양모를 메이트. 약어: YFP = 황형 단백질; GVBD = 발아 소포 고장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 0-2 h 및 8-10 h의 성숙에서 계산된 번역 속도. (A)노란 형광 단백질(YFP) 시로스타미드 방출 후 0-2h 또는 8-10h에서 mCherry(YFP/mCherry)를 보정한 단일 난십성 단백질(YFP/mCherry)의 신호와(B)번역속도(평균의 ± 표준 오차)는 곡선 피팅(선형 회귀)에 의해 계산된 YFP/mCherry 값을 0-2 h-1h9 후 YFP/mCherry 값0-2h및 80h9h에서 0-2h로 산출하였다. 데이터는 페어링되지 않은 두 꼬리 t-테스트를 사용하여 분석되었습니다. *p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 번역 억압의 예 : Oosp2. Ypet-Oosp2 3′ UTR 및 폴리아데니얼mRNA 인코딩 mCherry로 난모세포가 주입된 실험의 데이터를 다시 분석했습니다. YFP 신호는 Prophase I-체포(N=63) 및 성숙 난소(N=72)의 주입된 부피에 대해 YFP 신호를 마지막 10시간 지점의 평균 mCherry 신호로 나누어 수정하였다. YFP 및 mCherry 발현 데이터는 LED 광원이 사용된 IL-7 실험과 달리 제논 아크 램프를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 개별 난모세포 측정 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타내며 이전에 Luong 외에게시되었습니다. 5. 약어 : YFP = 노란색 형광 단백질; oosp2 = 난미염 분비 단백질 2; UTR = 번역되지 않은 지역; IL-7 = 인터류신-7; LED = 발광 다이오드; GVBD = 발아 소포 고장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: GVBD 및 PBE의 타이밍에 미세 주입 및 형광 노출의 효과. 형광에 마이크로 주입되고 노출된 난모세포의 GVBD 및 PBE의 타이밍(주입), 또는 주입되지 않고 형광에 노출되지 않음(주입되지 않음). 데이터는 개별 난해 측정입니다. 데이터는 페어링되지 않은 두 꼬리 t-test를사용하여 분석되었습니다. *p<0.001. 약어: GVBD = 발아 소포 고장; PBE = 극지 체압. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 기본 난피테 컬렉션 매체 | ||
| 구성 요소 | 500mL용 | |
| HEPES 수정 최소 필수 중간 이글 | 7.1 g | |
| 중탄산나트륨 | 252 mg | |
| 피루바테 나트륨 | 1.15 mL | |
| 페니실린/연쇄절제술 100x | 5 mL | |
| 초순수 증류수(인비트로겐, 10977-015) | 최대 500mL | |
| 성숙 배지 | ||
| 구성 요소 | 500mL용 | |
| MEM 알파 1x | 최대 500mL | |
| 피루바테 나트륨 | 1.15 mL | |
| 페니실린/연쇄절제술 100x | 5 mL | |
표 1: 미디어 준비. 기본 난피테 수집 매체 및 난모세포 성숙 배지를 준비하기 위해 추가해야 하는 구성 요소 목록입니다.
| 순서 | |||||
| 이펫/인터류신-7 3' UTR | 가가액트GCTTACTCTCTTATCGAATAATAATAATAATAATAACTACTACTATAGG가가카AGCTG GC타타그CTGGTACCAGAGAGAGAGAGAGACCGGAGACCGGGGGGAGAGAGAGAGATGGAGATGGAGATGGGTGAGCAAGAGAGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGTGTGTCCATCCATCCTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGAACGGGGGGGGCC 아사그타카GCGTGAGCGGCGAGGGGGGGAGGCGACGCCACCTACAGAGAGCTCTGCTG AAGCTGCTGTGCACCACCACCAGAGAGAGAGAGCCGTGCCCTGGCCCCCCCCCCTGACCCTG GGCTACGGGGCGTGCAGTGCTTCGCGGTACCCCGACCACATGAAAGCACGACTTCTCTTCTCA 아가그CGCCATGCCCGAGGTACGTGCAGGAGCGGACCAGGAGCGGACCATCTCTTCAAGGACGACGGCAAA CTACAAGAGCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGCGACACTGGGACCGGGGGGGGGGGG AGGCATCGACTTCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACAC AGCCACAACGTGTACATCCGAAGCAAGCAAGGAAGGAAGGAAGAGAGAGAGAGAGCAAGAGCAAGCAAGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAAACATCGAGAGAGAGAGCGGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCTGCTGCGAACCACCACCTGAGCTACCTGAGCTACCAGAGCTCT TTCAAGACCAACAGAGCGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG GGCATCACCGAGGGCATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTCTCGAAGGAAGGAAAGCCTATCCCTA CCCTCTCCTCGGTCTCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGTGTACCGTACCGGGGCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATGAACAGGACAC ATGTAGTAACATCCAAATCTACTTTTTCATATACTTGGAGAGGTTGAGAAACCCTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTCAAATAAGCCAAGAGAGCTGAGAAATCTACAGTGTATGGG 아가트가가아가트GCAGAGAGAGAGGACTGCTGCTGCTCGTCAGCATATACA타타타와타카아타카아타카아 CTATACAGATTTGTAATGCAATCATCAACTGCAATGCTTAAACCGTTCCAATGTTTC 타악타카아아아GTACAAAAGCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATGAAGAAGAAGACCACCACTGTTCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAAATGATGGTATGGTTAAAAACATTGAACCACTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT ACTGGAGATACTGGAGGAGGGCTCACGGATGATATATGCTGAAAAACAAGAGTCTATCTTATCTTAAAAAAAAAGC AGCAGCAAAAAGAAGCTTAAGTAAGTAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATAAATAATAAATAAATGAATG타타카카 카타액트카GTAAAAGATAAGATATTTAAAAAAGTATTTTTAAAAAAAAAAATTTTTAA가타가트GCACTTAT TCCAAAGATACTGAACCT타그T타그TCAGTCGCTTTGACACTTGTGTATAATAAGCTTATATAAGCTTATATAACTGAAAAA TTTTCAATTTGAAAAAAGTATTTTTAAAAATATATGC타택트타트GTTTTTTTTT TGGCATTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTATCTATATATA ATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGTTTCTCTTTTAACCTAACCTAATAATTTATTAACAC TGTCAGGTTCCCTCTCTCTCTCGAGAGTTCATTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTATTGAACAC ATATCCTTAACACACTCACGTCCAGATT타가타그가타그랙타게타그액타가액타게타그액타액트타타트GT타가와 아악타TTTTTTTT타타GTAGGGTTATTCTTCTTATTCTTATCTCTAAGGCAGGCGATTGCACATGAGC 카나타트GCTTAAT타가타카에타카에타카타트TTTTTTTTTTTTTTTTCTTCTTTTACTTACAAGATGCCTACATATATCCTATTATTAT GTATATGCCTGTTTTTAATCCTTTTGTAAGGTCTGTTCCTTCCTTCCTCCGTGTAATGAAAAAAACACTA TGTTG타가그카가타트가아타아타아에이GTGTTTGTTTGTACTGAATTCTCTCTCTCCTTGCTTTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTCTATC타타CGCTGGATGTATTTGACCGATGCCTCCACTGGCAC ATTGCATGTGTGGTAGTAGGTCTCTCTTGCTTCTCCTTCCCCAACCCC타타타트GCTCTACTCAGTGGGG 타카가타그가르트가가타트카타아카타타카타타카타카타타카카타타카카타카카타트 GCCCAGAAAAACAGTCTCTCTCTCTCTTGTTTGCAAAATAATAAAAAAAAACTCAAACTCAATTGTTTAATGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGTCCGTCCTGTCCTGTCCTGTCCTGTCCTGAGGAACTGGGGGGGGTAAAAATGGGTA AGCCCTTAGT타그맥아가아가그타아AGAAGATCTATCTATACCTGCAAGCTGTGGAT GGCTCCCTACCAATTGAATTGAATTATTATTATTGATTTTGGCAAAAAAGGAATATATATTTT |
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| 포워드 프라이머 | 가가액트GCTTAC | ||||
| 역프라이머 | TTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATTTTTTTTTTTG CCAAAATC |
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표 2: YFP/IL7 3'UTR 리포터 및 체외 전사를 위한 선형 PCR 템플릿을 생성하는 데 사용된 전방 및 역 프라이머의시퀀스의 리포터 및 프라이머 시퀀스의 예.
보충 파일: 황색 형광 단백질(YFP) 및 mCherry 시간 경과 기록. YFP와 mCherry 타임랩스 레코딩 mRNAs로 주입 된 단일 난소 세포의 레코딩 Ypet/ Interleukin-7 3' UTR 및 polyadenylated mCherry. YFP 채널 (예: S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), mCherry 채널 (예: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m). 난모세포는 16시간(7프레임/초)에 대해 15분마다 기록되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 방법은 시험관 내 oocyte meiotic 성숙 도중 다른 전환에서 표적 mRNA의 번역의 활성화 그리고 억압을 공부하는 전략을 설명합니다. IL-7은 난낭구-적혈구 세포 통신8,13에관여할 수 있는 난모세포에 의해 방출된 사이토카인이 본 방법을 설명하기 위해 선택되었다. IL-7은 난마귀 성숙도 8 동안 점점 더 번역되는 것으로 알려져 있으며, 이 방법을 사용하여 번역 활성화의 좋은 시각화를 허용한다. 그러나 실험 전반에 걸쳐 일정한 속도로 번역이 발생하면 리포터의 축적이 선형 패턴을 따르며 실험 의 시작과 끝에 있는 번역 속도는 유사합니다. 이러한 결론은 전체 기록 간격을 통해 선형 회귀의 적합성(R)의 적합성(R)에 의해 확인할 수 있습니다. 기자 번역의 억압은 YFP 신호의 고원으로 나타납니다.
3'UTR 번역의 억압의 예는 Luong 외의 연구에서 찾을 수있습니다. 5,저자는 oocyte 메이오틱 성숙 동안 Oocyte 분비 단백질 2 (Oosp2)의 억압을보고. 이러한 데이터는 다시 분석되었으며 그림 6에표시됩니다. 성숙한 난초는 번역의 억압을 나타내는 YFP 신호의 고원을 나타내며, I-체포 된 대조군은 실험의 시작과 끝에 유사한 번역 속도를 나타내는 기자 축적의 선형 패턴을 따릅니다. 번역의 억압을 연구할 때, YPF 신호의 고원이 열악한 문화 조건으로 인한 난낭질 의 감소에 의해 설명되지 않도록 하기 위해 prophase I-체포 대조군을 포함하는 것이 특히 중요하다, 따라서 난모세포의 생존가능성을 확인. 리포터의 축적은 YFP용 프라이머를 이용한 정량적 역전사 PCR 또는 이 프로토콜에 포함된 V5-에피토프 태그를 이용하여 서부 블로팅에 의해 검증될 수 있다.
YFP 신호의 고원은 번역의 적극적인 억압에 의한 것이 아닐 수도 있지만, 난소메이오틱 진행 중 기자의 저하에 의해 설명될 수도 있다. 이는 배아 게놈 발현(14,15,16)으로의전이에 필수적인 내인성 mRNA의 불안정화를 미러로 할 수 있다. 이러한 가능성은 mRNA의 안정성을 확인하기 위해 prophase I 단계에서 표적 유전자 전사 수준을 측정하여 확인할 수 있다. oocyte cDNA를 준비할 때, 올리고 dT 프라이밍을 통해 임의의 hexamer 프라이밍을 사용하는 것이 바람직하다. 후자의 방법은 성적증명서 수준7의실제 차이보다는 이러한 성적증명서의 폴리(A) 길이의 차이를 반영할 수 있는 유전자 성적증명서 수준에서 명백한 차이를 제시한다.
마우스 난모세포에서 게놈 전체 내인성 mRNA 번역을 연구하는 몇 가지 방법이 있습니다. 이러한 방법에는 폴리섬 프로파일링7,17,18 및 리보태그/RNA-Seq5,19,20을포함한다. 리보솜 프로파일링은 효모에서 사용되어 온 게놈 전체 번역을 연구하는 또 다른 방법이며, 이는 meiosis21,22를연구하는 데 사용되는 또 다른 모델 유기체이다. 그러나, 마우스에서 mRNA 번역을 연구하기 위한 이러한 게놈 전체 분석은 시료당 150-200 개의 난토를 사용해야 하며 분석에 사용할 수 있는 난모세포의 수는 일반적으로 제한적이다. 본명에 기재된 단일 오낭 분석법은 3' UTR의 표적 mRNA 번역을 평가하기 위해, 오피세포 메이오틱성숙4,5,6동안 번역 프로그램을 조절하는 3' UTR의 요소의 특성화를 허용하기 때문에 번역의 게놈 전체 분석을보완한다. 과거에는, 루시파라제계 의 소사는 샘플당 몇 가지 난마세포만을 필요로 하는 매우 민감한 방법이기 때문에 표적 mRNAs10,20,23의 3'UTR의 번역을 평가하기 위해 사용되었다; 그러나, 난모세포는 샘플에서 루시파라제의 양을 검출하기 위하여 lysed 될 필요가 있습니다.
다른 사람들은 살아있는 마우스 oocytes4에서GFP 축적을 평가하기 위하여 3' UTR/녹색 형광 단백질 (GFP) 기자를 이용했습니다. 그러나, 이러한 실험에서, 두 개의 시간 포인트가 사용되었다: 인큐베이션의 시작 (prophase I) 및 인큐베이션의 끝 (메타 페이트 II). 이렇게 하면 측정의 힘이 크게 줄어들고 오류 가능성이 높아집니다. Kinetic 데이터는 속도(여러 점)에 따라 정확한 측정을 제공하고 번역 활성화 또는 억압이 발생하는 시간을 정확하게 정의합니다. 또한, 번역의 억압은 부정확한 결론으로 이어질 수있는 이러한 단일 시간 지점에서 평가 할 수 없습니다. 따라서, 이 방법은 마우스 난모세포의 시험관 내 성숙을 통해 Ypet/3'UTR 기자 축적을 평가하기 위해 시간 경과 현미경 검사를 적용하여 조정하였다5,6,9. 이 전략을 사용 하 여, 난모 세포 성숙 하는 동안 다른 전환에서 번역을 공부 할 수 있습니다.
이 방법에는 고려해야 할 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 첫째, 기자는 누락이 기자 축적을 상당히 감소 올리고 (A) 꼬리를 포함한다. 이는 리포터 mRNA불안정(24, 25)뿐만아니라 번역이 모두 감소하기 때문일 수있다. prophase I에서 의 사전 인큐베이션 동안, 올리고아데니라드 프로브의 번역은 내인성 mRNA5의번역 속도를 반영하도록 조정한다. 둘째, 형광 노출의 기록 수 또는 지속 시간이 증가하면 잠재적으로 광독성을 유발하여 oocyte 품질을 손상시킬 수 있다는 것을 깨닫는 것이 중요합니다. 현재 실험은 15분 간격을 채택했지만, 낮은 리포터 발현의 경우 높은 형광 노출을 사용해야 할 때 샘플링 속도가 감소될 수 있다.
광독성의 양을 제한하기 위해, 차가운 LED 광원이 사용되어 더 짧은흥분(26)이필요하다. 난모세포에 있는 잠재적인 광독성 효력을 평가하기 위하여는, GVBD와 PBE의 타이밍은 형광에 마이크로 주입되고 드러나는 난투에서 또는 주입되지 않고 형광에 드러내지 않는 난모세포에서 비교되었습니다. 마이크로 주사및 형광 노출의 조합은 GVBD (p<0.001)를 약간 지연하는 것으로 나타났으며 PBE의 타이밍은 유사했습니다(그림 7).
이 방법은 시험관 내 난소 수막 메이오틱 성숙 중에 3'UTR의 번역 조절 요소를 연구하는 데 사용되었습니다. 유사하게, 또한 번역의 조절에 필수적인 기능 5' UTR 요소를 연구하거나 체외 난소 수정 중에 번역을 공부하는 데 사용될 수있다. 이 방법은 인간과 마우스 난모세포에 적용되었지만 다른 동물 종에도 적용됩니다. 이 기자 분석은 단일 난모세포에서 수행되기 때문에 분석에 사용할 수있는 난낭의 수가 제한된 모노 배란 종에서 사용하기에 특히 적합합니다. 이 기술의 또 다른 적용은 적수 세포가 번역 프로그램8,10,27의조절에 중요한 역할을 하기 때문에 기자를 적분동 난모세포로 주입하는 것이다. 그러나, COC 팽창 시 적혈구의 움직임으로 인해 난모세포가 제거된 것과 비교하여 실험 중에 적수동 난모세포가 기록 평면에서 멀어질 가능성이 더 높다는 점을 고려해야 한다. 이로 인해 분석에서 제외해야 하는 난모세포의 비율이 더 커질 수 있습니다. 미래에는 이 문제를 해결할 수 있는 물방울에서 난모세포의 x, y 및 z 위치를 추적할 수 있는 셀 트래킹 소프트웨어가 사용될 수 있다.
결론적으로, 설명된 단일 난십화 기자 분석은 난소세포-zygote 전환에서 실행되는 번역 프로그램을 조사하는 전략을 나타냅니다. 이 번역 프로그램에 대한 지식이 증가하면 난소 세포 발달 능력의 분자 조절에 대한 중요한 단서를 제공 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 GM097165, GM116926 및 유니스 케네디 슈리버 NICHD 국립 재생 및 불임 P50 HD055764에서 마르코 콘티에 의해 지원되었다. 엔리코 M. 달델로는 랄로 재단의 펠로우십에 의해 지원되었고 나타자 G. J. 코스터만스는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)의 루비콘 펠로우십에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
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