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Medicine

Valutazione in tempo reale della microperfusione del midollo spinale in un modello suino di ischemia/riperfusione

Published: December 10, 2020
doi:
10.3791/62047
, , , , , , , , , , ,
1Department of Anesthesiology, Center of Anesthesiology and Intensive Care Medicine,University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2University Department for Vascular Surgery and Department of Operative Medicine,Medical University of Innsbruck, 3Department of Medical Biometry and Epidemiology,University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Vascular Medicine,University Heart and Vascular Center Hamburg (UHZ), 5Department of Cardiology,Rostock University Medical Center, 6University Department for Cardiac Surgery,Heart Center Leipzig

Summary

La microcircolazione del midollo spinale svolge un ruolo fondamentale nella lesione del midollo spinale. La maggior parte dei metodi non consente la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale, che è essenziale per lo sviluppo di terapie mirate alla microcircolazione. Qui, proponiamo un protocollo che utilizza sonde Laser-Doppler-Flow Needle in un modello animale di ischemia/ riperfusione di grandi dimensioni.

Abstract

La lesione del midollo spinale è una complicanza devastante della riparazione aortica. Nonostante gli sviluppi per la prevenzione e il trattamento delle lesioni del midollo spinale, la sua incidenza è ancora considerevolmente elevata e, pertanto, influenza l’esito del paziente. La microcircolazione svolge un ruolo chiave nella perfusione tissutale e nell’apporto di ossigeno ed è spesso dissociata dalla macroemodinamica. Pertanto, la valutazione diretta della microcircolazione del midollo spinale è essenziale per lo sviluppo di terapie mirate alla microcircolazione e la valutazione degli approcci esistenti per quanto riguarda la microcircolazione del midollo spinale. Tuttavia, la maggior parte dei metodi non fornisce una valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale. Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un protocollo standardizzato per la valutazione microcircolatoria del midollo spinale in tempo reale utilizzando sonde ad ago laser-Doppler inserite direttamente nel midollo spinale. Abbiamo usato un modello suino di ischemia/riperfusione per indurre il deterioramento della microcircolazione del midollo spinale. Inoltre, è stata utilizzata una tecnica di iniezione di microsfere fluorescenti. Inizialmente, gli animali sono stati anestetizzati e ventilati meccanicamente. Successivamente, è stato eseguito l’inserimento della sonda ad ago laser-Doppler, seguito dal posizionamento del drenaggio del liquido cerebrospinale. È stata eseguita una sternotomia mediana per l’esposizione dell’aorta discendente per eseguire il cross-clamping aortico. L’ischemia/riperfusione è stata indotta da cross-clamping aortico sopra-celiaco per un totale di 48 min, seguito da riperfusione e stabilizzazione emodinamica. Laser-Doppler Flux è stato eseguito in parallelo con la valutazione macroemodinamica. Inoltre, il drenaggio automatico del liquido cerebrospinale è stato utilizzato per mantenere una pressione cerebrospinale stabile. Dopo il completamento del protocollo, gli animali sono stati sacrificati e il midollo spinale è stato raccolto per l’analisi istopatologica e della microsfera. Il protocollo rivela la fattibilità di misurazioni di microperfusione del midollo spinale utilizzando sonde laser-Doppler e mostra una marcata diminuzione durante l’ischemia e il recupero dopo la riperfusione. I risultati hanno mostrato un comportamento paragonabile alla valutazione della microsfera fluorescente. In conclusione, questo nuovo protocollo potrebbe fornire un utile modello animale di grandi dimensioni per studi futuri che utilizzano in tempo reale la valutazione della microperfusione del midollo spinale in condizioni di ischemia / riperfusione.

Introduction

La lesione del midollo spinale indotta da ischemia/riperfusione (SCI) è una delle complicanze più devastanti della riparazione aortica associata a esito ridotto1,2,3,4. Le attuali opzioni di prevenzione e trattamento per SCI includono l’ottimizzazione dei parametri macroemodinamici e la normalizzazione della pressione del liquido cerebrospinale (CSP) per migliorare la pressione di perfusione del midollo spinale2,5,6,7,8,9. Nonostante l’implementazione di queste manovre, l’incidenza di SCI varia ancora tra il 2% e il 31% a seconda della complessità della riparazione aortica10,11,12.

Recentemente, la microcircolazione ha guadagnato maggiore attenzione13,14. La microcircolazione è l’area di assorbimento di ossigeno cellulare e di scambio metabolico e, pertanto, svolge un ruolo fondamentale nella funzione degli organi e nell’integrità cellulare13. Il flusso sanguigno microcircolatorio alterato è un importante determinante dell’ischemia tissutale associata ad un aumento della mortalità15,16, 17,18,19. La compromissione della microcircolazione del midollo spinale è associata a una ridotta funzione neurologica e all’esito20,21,22,23. Pertanto, l’ottimizzazione della microperfusione per il trattamento della SCI è un approccio molto promettente. La persistenza dei disturbi microcircolatori, nonostante l’ottimizzazione macrocircolatoria, è stata descritta26,27,28,29. Questa perdita di coerenza emodinamica si verifica frequentemente in varie condizioni tra cui ischemia/riperfusione, sottolineando la necessità di una valutazione microcircolatoria diretta e di terapie mirate alla microcircolazione26,27,30.

Finora, solo pochi studi hanno utilizzato sonde laser-Doppler per la valutazione in tempo reale del comportamento microcircolatorio del midollo spinale20,31. Gli studi esistenti hanno spesso utilizzato tecniche di iniezione della microsfera, che sono limitate dall’uso intermittente e dall’analisi post-mortem32,33. Il numero di diverse misurazioni che utilizzano la tecnica di iniezione della microsfera è limitato dalla disponibilità di microsfere con diverse lunghezze d’onda. Inoltre, a differenza delle tecniche Laser-Doppler, la valutazione in tempo reale della microperfusione non è possibile, poiché per questo metodo è necessaria l’elaborazione e l’analisi dei tessuti post-mortem. Qui presentiamo un protocollo sperimentale per la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale in un modello animale sucino di grandi dimensioni di ischemia/riperfusione.

Questo studio faceva parte di un grande progetto su animali che combinava uno studio randomizzato che confrontava l’influenza dei cristalloidi rispetto ai colloidi sulla microcircolazione in ischemia / riperfusione e uno studio randomizzato esplorativo sugli effetti dei fluidi rispetto ai vasopressori sulla microperfusione del midollo spinale. La calibrazione a 2 punti della sonda di flusso e la calibrazione del catetere a punta di pressione sono state precedentemente descritte34. Oltre al protocollo riportato, sono state utilizzate microsfere fluorescenti per la misurazione della microperfusione del midollo spinale, come precedentemente descritto, utilizzando 12 campioni di tessuto del midollo spinale per ciascun animale, con campioni 1-6 che rappresentano il midollo spinale superiore e 7-12 che rappresentano il midollo spinale inferiore35,36. L’iniezione di microsfere è stata eseguita per ogni fase di misurazione dopo il completamento delle registrazioni Laser-Doppler e della valutazione macroemodinamica. La valutazione istopatologica è stata eseguita utilizzando il Kleinman-Score come precedentemente descritto37.

Protocol

Lo studio è stato approvato dalla Commissione governativa per la cura e l’uso degli animali della città di Amburgo (riferimento n. 60/17). Gli animali hanno ricevuto cure in conformità con la “Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio” (pubblicazione NIH n. 86-23, rivista nel 2011) e le raccomandazioni e gli esperimenti FELASA sono stati condotti secondo le linee guida ARRIVE24,25. Questo studio è stato uno studio acuto e tutti gli animali sono s…

Representative Results

Tutti e sei gli animali sono sopravvissuti fino al completamento del protocollo. Il peso degli animali era di 48,2 ± 2,9 kg; cinque animali erano maschi e un animale era femmina. L’inserimento della sonda dell’ago del midollo spinale e la misurazione del flusso del midollo spinale erano fattibili in tutti gli animali. Esempi di registrazioni microcircolatorie del midollo spinale in tempo reale in combinazione con registrazioni …

Discussion

La SCI indotta dall’ischemia del midollo spinale è una delle principali complicanze della riparazione aortica con un enorme impatto sull’esito del paziente1,2,3,4,10,11,12. Le terapie mirate alla microcircolazione per prevenire e curare la SCI sono le più promettenti. Il protocollo fornisc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Lena Brix, V.M.D, Institute of Animal Research, Hannover Medical School, così come la signora Jutta Dammann, Facility of Research Animal Care, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Germania, per aver fornito cure pre e perioperatorie agli animali e la loro assistenza tecnica sulla manipolazione degli animali. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il Dr. Daniel Manzoni, Dipartimento di Chirurgia Vascolare, Hôpital Kirchberg, Lussemburgo, per la sua assistenza tecnica.

Materials

CardioMed Flowmeter Medistim AS, Oslo, Norway CM4000 Flowmeter for Flow-Probe Femoral Artery
CardioMed Flow-Probe, 5mm Medistim AS, Oslo, Norway PS100051 Flow-Probe Femoral Artery
COnfidence probe,  Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA MA16PAU Flow-Probe Aorta
16 mm liners
DIVA Sevoflurane Vapor Dräger Medical, Lübeck, Germany Vapor
Hotline Level 1 Fluid Warmer Smiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, Germany HL-90-DE-230 Fluid Warmer
Infinity Delta Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Monitoring Hardware
Infinity Hemo Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Pressure Monitoring and Pulmonary Thermodilution Hardware
LabChart Pro ADInstruments Ltd., Oxford, UK v8.1.16 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Software
LiquoGuard 7 Möller Medical GmbH, Fulda, Germany Cerebrospinal Fluid Drainage System
Millar Micro-Tip Pressure Catheter (5F, Single, Curved, 120cm, PU/WD) ADInstruments Ltd., Oxford, UK SPR-350 Pressure-Tip Catheter Aorta
moor VMS LDF moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Hardware
moor VMS Research Software moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Software
Perivascular Flow Module Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA TS 420 Flow-Module for Flow-Probe Aorta
PiCCO 2, Science Version Getinge AB, Göteborg, Sweden v. 6.0 Blood Pressure and Transcardiopulmonary Monitoring Hard- and Software
PiCCO 5 Fr. 20cm Getinge AB, Göteborg, Sweden Thermistor-tipped Arterial Line 
PowerLab ADInstruments Ltd., Oxford, UK PL 3516 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Hardware
QuadBridgeAmp ADInstruments Ltd., Oxford, UK FE 224 Four Channel Bridge Amplifier for Laser-Doppler and Invasive Blood Pressure Aquisition
Silverline Spiegelberg, Hamburg, Germany ELD33.010.02 Cerebrospinal Fluid Drainage
SPSS statistical software package  IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USA v. 27 Statistical Software
Twinwarm Warming System Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 12TW921DE Warming System
Universal II Warming Blanket Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 906 Warming Blanket
VP 3 Probe, 8mm length (individually manufactured) moor Instruments, Devon, UK Laser-Doppler Probe
Zeus Dräger Medical, Lübeck, Germany Anesthesia Machine
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Behem, C. R., Friedheim, T., Wipper, S. H., Pinnschmidt, H. O., Graessler, M. F., Gaeth, C., Holthusen, H., Rapp, A., Suntrop, T., Haunschild, J., Etz, C. D., Trepte, C. J. C. Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion. J. Vis. Exp. (166), e62047, doi:10.3791/62047 (2020).
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