תגובת לב לגירוי β-אדנרגיות שנקבע על ידי ניתוח לולאת נפח לחץ
Summary
כאן אנו מתארים ניתוח לולאת לחץ לב תחת מינונים הולכים וגדלים של איזופרוטרנול תוך ורידי כדי לקבוע את תפקוד הלב המהותי ואת המילואים β-adrenergic בעכברים. אנו משתמשים בגישה שונה של חזה פתוח למדידות לולאת נפח הלחץ, שבה אנו כוללים אוורור עם לחץ חיובי של תפוגת קצה.
Abstract
קביעת תפקוד הלב היא ניתוח נקודת קצה חזק במודלים של בעלי חיים של מחלות לב וכלי דם על מנת לאפיין השפעות של טיפולים ספציפיים על הלב. בשל היתכנות של מניפולציות גנטיות העכבר הפך למודל החייתי היונקים הנפוץ ביותר לחקר תפקוד הלב ולחיפוש אחר מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע את תפקוד הלב ב vivo באמצעות מדידות לולאה נפח לחץ וניתוח במהלך מצבים בסיסיים ותחת גירוי β-adrenergic על ידי עירוי תוך ורידי של הגדלת ריכוזים של isoproterenol. אנו מספקים פרוטוקול מעודן כולל תמיכה באוורור תוך התחשבות בלחץ חיובי של תפוגת קצה כדי לשפר השפעות שליליות במהלך מדידות חזה פתוח, ומשככי כאבים חזקים (Buprenorphine) כדי למנוע מתח שריר הלב בלתי נשלט מעורר על ידי כאב במהלך ההליך. כל זאת יחד התיאור המפורט של ההליך והדיון על מלכודות אפשריות מאפשר ניתוח לולאת נפח לחץ סטנדרטי מאוד וניתן לשחזור, ומפחית את הדרת בעלי החיים מהחבורה הניסיונית על ידי מניעת הטיה מתודולוגית אפשרית.
Introduction
מחלות לב וכלי דם משפיעות בדרך כלל על תפקוד הלב. בעיה זו מצביעה על החשיבות בהערכת תפקוד הלב המפורט של vivo במודלים של מחלות בעלי חיים. ניסויים בבעלי חיים מוקפים במסגרת של שלושת העקרונות המנחים של Rs (3Rs) (צמצום/מקד/החלפה). במקרה של הבנת פתולוגיות מורכבות המערבות תגובות מערכתיות (כלומר, מחלות לב וכלי דם) ברמה ההתפתחותית הנוכחית, האפשרות העיקרית היא לחדד את השיטות הזמינות. זיקוק יוביל גם לירידה במספרי בעלי החיים הנדרשים בשל פחות שונות, מה שמשפר את כוח הניתוח והמסקנות. בנוסף, שילוב של מדידות התכווצות לב עם מודלים בעלי חיים של מחלות לב כולל אלה המושרה על ידי גירוי נוירוהומורלי או על ידי עומס יתר בלחץ כמו פסים בתחום העורקים, אשר מחקה למשל קטכולאמין שונה / β-adrenergic רמות1,2,3,4, מספק שיטה חזקה למחקרים פרה קליניים. אם ניקח בחשבון כי השיטה מבוססת צנתר נשאר הגישה הנפוצה ביותר להערכה מעמיקה של התכווצות הלב5, אנו שואפים להציג כאן מדידה מעודנת של תפקוד הלב in vivo בעכברים על ידי לולאת נפח לחץ (PVL) מדידות במהלך גירוי β-adrenergic המבוסס על ניסיון קודם כולל הערכה של פרמטרים ספציפיים של גישה זו6, 7.
כדי לקבוע גישות פרמטרים המודינמיים לב הכוללים הדמיה או טכניקות מבוססות צנתר זמינים. שתי האפשרויות מלוות ביתרונות וחסרונות שיש לשקול בזהירות לשאלה המדעית המתאימה. גישות ההדמיה כוללות אקוקרדיוגרפיה והדמיה תהודה מגנטית (MRI); שניהם שימשו בהצלחה בעכברים. מדידות אקוקרדיוגרפיות כרוכות בעלויות ראשוניות גבוהות מבדיקה במהירות גבוהה הנדרשת לקצב הלב הגבוה של העכברים; זוהי גישה פשוטה יחסית לא פולשנית, אך היא משתנה בקרב מפעילים אשר באופן אידיאלי צריך להיות מנוסה זיהוי והדמיה של מבני לב. בנוסף, לא ניתן לבצע מדידות לחץ ישירות וחישובים מתקבלים משילוב של סדרי גודל ומדידות זרימה. מצד שני, יש לו את היתרון כי מספר מדידות ניתן לבצע על אותה חיה ותפקוד הלב ניתן לפקח למשל במהלך התקדמות המחלה. לגבי מדידת הנפח, ה- MRI הוא הליך תקן הזהב, אך בדומה לאקוקרדיוגרפיה, אין מדידות לחץ ישירות אפשריות וניתן להשיג רק פרמטרים תלויים בטעינה מראש8. גורמים מגבילים הם גם הזמינות, מאמץ הניתוח ועלויות התפעול. כאן שיטות מבוססות קטטר למדידת תפקוד הלב הן חלופה טובה המאפשרת בנוסף ניטור ישיר של לחץ תוך-לבבי וקביעת פרמטרים של התכווצות בלתי תלויה בעומס כמו עבודת שבץ גיוס מראש (PRSW)9. עם זאת, נפחי חדרית הנמדדים על ידי קטטר מוליכות לחץ (באמצעות קביעת מוליכות) קטנים יותר מאלה של ה- MRI אך הבדלי קבוצות נשמרים באותו טווח10. כדי לקבוע ערכי נפח אמינים, הכיול המתאים נדרש, שהוא צעד קריטי במהלך מדידות PVL. הוא משלב מדידות ex vivo של מוליכות דם ב cuvettes מכויל נפח (המרה של מוליכות לנפח) עם ניתוח in vivo עבור מוליכות מקבילה של שריר הלב במהלך הזרקת בולוס של תמיסת מלחהיפרטונית 11,12. מעבר לכך, מיקום הקטטר בתוך החדר והכיוון הנכון של האלקטרודות לאורך ציר האורך של החדר הם קריטיים ליכולת הזיהוי של השדה החשמלי שמסביב המיוצר על ידיהם. עדיין עם גודל מופחת של לב העכבר ניתן להימנע חפצים המיוצרים על ידי שינויים בכיוון תוך חדרי של הקטטר, אפילו בחדרים המורחבים5,10, אבל חפצים יכולים להתפתח תחת גירוי β-adrenergic6,13. בנוסף לשיטות ההולכה נראה כי פיתוח השיטה מבוססת האשפוז נמנעה מכללי הכיול, אך כאן ערכי הנפח מוערכים יתר עלהמידה 14,15.
מאז העכבר הוא אחד המודלים הקדם קליניים החשובים ביותר במחקר לב וכלי דם ואת β–עתודה אדנרגיית של הלב הוא עניין מרכזי בפיזיולוגיה לב ופתולוגיה, אנו מציגים כאן פרוטוקול מעודן כדי לקבוע בתפקוד הלב vivo בעכברים על ידי מדידות PVL במהלך גירוי β-adrenergic.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לנתח את תפקוד הלב in vivo בעכברים תחת הגדלת גירוי β-adrenergic. ההליך יכול לשמש כדי לטפל בשניהם, פרמטרים בסיסיים של תפקוד הלב ואת עתודה adrenergic (למשל, inotropy ו כרונוטרופיה) בעכברים מהונדסים גנטית או על התערבויות. היתרון הבולט ביותר של מדידות לולאת נפח לחץ (PVL) בהשוואה לאמצעים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למנואלה ריצל, הנס-פיטר גנשהיימר, כריסטין ריכטר והצוות מאינטרפאקולטר ביומדיזינישה פורשונגסיינריכטונג (IBF) מאוניברסיטת היידלברג לסיוע טכני מומחה.
עבודה זו נתמכה על ידי DZHK (המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם), BMBF (משרד החינוך והמחקר הגרמני), באדן-וירטמברג חדשנות המדינה הפדרלית וחיבה לחדשנות של המדינה הפדרלית דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) פרויקט-ID 239283807 – TRR 152, עבור 2289 ומרכז המחקר השיתופי (SFB) 1118.
Materials
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
References
- Bacmeister, L., et al. Inflammation and fibrosis in murine models of heart failure. Basic Research in Cardiology. 114 (3), 19 (2019).
- Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Reviews Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovascular Research. 39 (1), 60-76 (1998).
- Lefkowitz, R. J., Rockman, H. A., Koch, W. J. Catecholamines, cardiac beta-adrenergic receptors, and heart failure. Circulation. 101 (14), 1634-1637 (2000).
- Cingolani, O. H. K. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 2198-2206 (2011).
- Bacmeister, L., et al. Assessment of PEEP-Ventilation and the Time Point of Parallel-Conductance Determination for Pressure-Volume Analysis Under beta-Adrenergic Stimulation in Mice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 36 (2019).
- Segin, S., et al. Cardiomyocyte-Specific Deletion of Orai1 Reveals Its Protective Role in Angiotensin-II-Induced Pathological Cardiac Remodeling. Cells. 9 (5), (2020).
- Clark, J. E., Marber, M. S. Advancements in pressure-volume catheter technology – stress remodelling after infarction. Experimental Physiology. 98 (3), 614-621 (2013).
- Glower, D. D., et al. Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work. Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).
- Winter, E. M., et al. Left ventricular function in the post-infarct failing mouse heart by magnetic resonance imaging and conductance catheter: a comparative analysis. Acta Physiologica. 194 (2), 111-122 (2008).
- Krenz, M. Conductance, admittance, and hypertonic saline: should we take ventricular volume measurements with a grain of salt. Journal of Applied Physiology. 107 (6), 1683-1684 (2009).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Wei, A. E., Maslov, M. Y., Pezone, M. J., Edelman, E. R., Lovich, M. A. Use of pressure-volume conductance catheters in real-time cardiovascular experimentation. Heart, Lung and Circulation. 23 (11), 1059-1069 (2014).
- van Hout, G. P., et al. Admittance-based Pressure-Volume Loops versus gold standard cardiac magnetic resonance imaging in a porcine model of myocardial infarction. Physiological Reports. 2 (4), 00287 (2014).
- Wei, C. L., Shih, M. H. Calibration Capacity of the Conductance-to-Volume Conversion Equations for the Mouse Conductance Catheter Measurement System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1627-1634 (2009).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Weiss, J. L., Frederiksen, J. W., Weisfeldt, M. L. Hemodynamic determinants of the time-course of fall in canine left ventricular pressure. Journal of Clinical Investigation. 58 (3), 751-760 (1976).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavioral Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Jacoby, C., et al. Direct comparison of magnetic resonance imaging and conductance microcatheter in the evaluation of left ventricular function in mice. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 87-95 (2006).
- Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 443-450 (2000).
- Calligaris, S. D., Ricca, M., Conget, P. Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50050 (2013).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942 (2015).
- Pearce, J. A., Porterfield, J. E., Larson, E. R., Valvano, J. W., Feldman, M. D. Accuracy considerations in catheter based estimation of left ventricular volume. Conference proceedings – IEEE engineering in medicine and biology society. 2010, 3556-3558 (2010).
- Nielsen, J. M., et al. Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 534-540 (2007).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiological Genomics. 42 (2), 103-113 (2010).
- Oosterlinck, W., Vanderper, A., Flameng, W., Herijgers, P. Glucose tolerance and left ventricular pressure-volume relationships in frequently used mouse strains. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 281312 (2011).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (5), 1829-1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
